Électrofusion cellulaire visualisé par microscopie à fluorescence

La fusion électrochimique implique l'application de courants électriques brefs et de haute tension à des cellules en contact étroit. Dans cette vidéo, nous démontrons la fusion électrochimique de cellules in vitro au moyen de la méthode d'adhérence modifiée. Les expériences ont été réalisées sur des cellules de mélanome de souris, BF une.

Pour l'expérience, suivez ces étapes. Faites croître les cellules dans deux flacons de culture distincts jusqu'à une confluence de 80 %. Ajoutez séparément 2,1 microlitres de chaque solution mère.

10 millimolaire de C-M-F-D-A ou de CMRA respectivement à trois millilitres de tampon Krebs Hess dans un tube à centrifuger. Rincer les cellules deux fois avec le tampon Krebs Hess, puis introduire les solutions de chargement dans les flacons. Les solutions de chargement contiennent environ sept micromoles de C-M-F-D-A ou de CMRA respectivement.

Incuber les cellules pendant 30 minutes dans une atmosphère contrôlée. Pendant cette première incubation, les régions traversent librement les membranes cellulaires pour pénétrer dans le cytosol, où elles sont transformées en produits de réaction perméants aux membranes IMP. Après cette première incubation, rincer puis incuber les cellules avec du milieu de culture pendant deux heures supplémentaires.

Les cellules sont observées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’une caméra CCD refroidie dans le logiciel d’acquisition. Régler la longueur d’onde d’excitation à 548 nanomètres et choisir un filtre passe-bande approprié pour l’image de fluorescence rouge des cellules chargées avec CMRA pour les cellules chargées avec C-M-F-D-A. Régler la longueur d’onde d’excitation à 492 nanomètres et choisir un filtre passe-bande pour l’image de fluorescence verte des trypsines, puis compter les cellules dans les deux flacons et mélanger les cellules rouges et vertes ensemble dans un rapport de un à un ; ajuster la concentration cellulaire à 5 millions de cellules par millilitre.

Déposez une goutte de 20 microlitres de suspension cellulaire au centre de chaque puits. Dans une plaque multi-puits de 24 puits, incubez les cellules dans une atmosphère contrôlée pendant 20 minutes afin de permettre aux cellules de s'attacher légèrement à la surface du puits en une monocouche et d'établir des contacts cellulaires entre elles. Placez la plaque multi-puits contenant les cellules sur la platine du microscope.

Positionnez les électrodes au fond du puits et reliez-les au générateur d'impulsions. Pour obtenir une électrofusion optimale et préserver la viabilité cellulaire, des paramètres adéquats d'impulsions électriques doivent être utilisés. Ces paramètres dépendent de la lignée cellulaire et doivent être déterminés lors d'expériences préliminaires. Éliminez le milieu de culture et lavez les cellules avec un millilitre de tampon phosphate de potassium ISO omu dans 350 microlitres de tampon phosphate de potassium hypotonique de Miller afin d'induire un gonflement cellulaire.

Laisser les cellules dans le tampon hyperosmotique pendant deux minutes avant d'appliquer les impulsions électriques. Les impulsions électriques doivent être appliquées lorsque les cellules sont proches de leur volume maximal, c'est-à-dire avant qu'elles ne commencent la régulation du volume.

Réduction dans notre expérience. Un train de huit impulsions rectangulaires d'une durée de 100 microsecondes à un hertz a été appliqué. Après la délivrance des impulsions.

Laisser les cellules au repos pendant 10 minutes après 10 minutes. Déterminer le rendement de diffusion au moyen d'un microscope à contraste de phase et de fluorescence. Acquérir trois images, en contraste de phase, en fluorescence rouge et verte, sur cinq champs aléatoirement choisis.

Dans chaque cas, nous créons trois images en couleurs à partir de chaque triplet d'images dans le logiciel ImageJ afin d'améliorer la qualité visuelle des images avant l'application d'étapes de prétraitement aux images d'origine, telles que la soustraction du fond, et des améliorations de contraste à l'aide de jeux de paramètres par défaut. Enfin, les images en trois canaux sont composées à l’aide du module complémentaire ImageJ RGB vers niveaux de gris. Sur une telle image, le cytoplasme au repos peut être observé en même temps que les membranes cellulaires.

Ainsi, peu de cellules peuvent être facilement déterminées dans le décompte d'image à trois canaux incluant les trois types de cellules : rouges, vertes et doublement fluorescentes. Déterminez le pourcentage de cellules doublement fluorescentes en divisant le nombre de cellules doublement fluorescentes par le nombre total de cellules dans chaque image. Le rendement de fusion est alors défini comme le pourcentage de cellules doublement fluorescentes multiplié par deux.

Étant donné que la moitié des cellules de vue ne sont pas détectées lorsque les cellules présentent des vues de la même couleur.