Lumière corrélative et microscopie électronique (CLEM) comme un outil pour visualiser des molécules et de leurs microinjecté eucaryotes Sous-cellulaires cibles

L'objectif général de l'expérience suivante est d'introduire des petites molécules ou des protéines marquées aux fluorochromes dans le cytoplasme d'une cellule de mammifère en culture, puis d'observer les changements morphologiques induits avec une résolution allant du micromètre au nanomètre. Cette observation est réalisée en cultivant d'abord des cellules de mammifère sur des lamelles en verre munies d'une grille, puis en leur injectant de façon microscopique une petite molécule ou une protéine d'intérêt marquée aux fluorochromes. Ensuite, les cellules sont fixées dans du formaldéhyde et observées, puis images prises à l'aide d'une microscopie à fluorescence.

Ensuite, les cellules sont fixées avec du glutaraldéhyde, sectionnées, colorées et observées par microscopie électronique. Enfin, les images prises en microscopie fluorescente en champ clair et en microscopie électron游戏副本

Bonjour, je suis le Dr. Evan Reddick, du laboratoire du Dr. Neil Alto, du département de microbiologie du centre médical de l'Université du Texas Southwestern à Dallas. Aujourd'hui, je vais vous parler de la procédure M Clem, ou microinjection en microscopie correlative de la lumière et de l'électron. L'avantage principal de cette procédure par rapport à des techniques isolées telles que la microinjection ou la microscopie, est qu'ici elles sont réalisées conjointement et facilitées par l'utilisation d'une lame de verre couvre-objet quadrillée.

C'est cette lame couvre-objet quadrillée qui permet aux chercheurs de revenir à la même cellule au cours de différentes étapes du protocole. En outre, cette technique offre au chercheur la possibilité d'observer des modifications architecturales subcellulaires induites par une grande variété de petites molécules injectables ou de protéines d'intérêt, et ce avec une résolution allant du micromètre au nanomètre. Pour préparer la microinjection, cultiver des cellules, telles que des cellules rénales de rat normales ou des cellules de cancer du col de l'utérus immortalisées, sur des lames couvre-objets en verre quadrillées par photograbage, fixées sur des boîtiers pour cellules vivantes, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 %CO2.

En fonction de la chronologie expérimentale prévue, ajustez la confluence des cellules. Une plaque entièrement confluente rendra l'identification des cellules microinjectées au microscope électronique très difficile. Par conséquent, ensemencez les cellules de manière à atteindre environ 50 % de confluence le jour d'une expérience courte et environ 25 % de confluence.

Le jour d'une expérience plus longue, préparez la protéine marquée de façon fluorescente, l'ADN ou les petites molécules dans le tampon approprié jusqu'à un volume final de 50 microlitres. Selon la fluorochrome choisi, ajoutez un colorant marqueur tel que le rouge Texas ou le bleu cascade. Ajoutez une concentration de 0,5 à 1 milligramme par millilitre.

Filtrer la solution à l’aide d’un filtre centrifuge de 0,22 micron. Après avoir préparé les micropipettes selon les instructions du fabricant, pipeter soigneusement quelques microlitres de solution dans l’extrémité arrière d’une micropipette. Charger la micropipette dans le bras du micromanipulateur d’un dispositif de microinjection commercial fixé à un microscope inversé.

Placer une boîte de cellules cultivées dans le support de la boîte du microscope inversé. Repérer les cellules en cours de croissance dans une grille photo-gravée et noter l'identifiant alphanumérique de la grille. Celui-ci sera utilisé dans toutes les étapes ultérieures.

Il est important de choisir des cellules pour la microinjection qui sont adhérées près du centre de la lame, et d'éviter celles situées près de la périphérie. Cela est essentiel afin d'assurer un transfert efficace de vos cellules d'intérêt vers le centre en résine époxy utilisé ultérieurement pour la microscopie électronique. Abaissez manuellement le bras d'injection au-dessus de la lame et utilisez le micromanipulateur pour descendre l'aiguille jusqu'à ce que sa pointe touche doucement la surface des cellules. Microinjectez une cellule sur deux dans la grille sélectionnée ; pour des cellules cultivées à environ 50 % de confluence, prévoyez environ 80 cellules par grille de 600 micromètres carrés, ce qui donnera un N d'environ 30 à 40 cellules expérimentales et contrôles.

Après l'injection, replacer la boîte dans l'incubateur pendant une durée souhaitée afin de réaliser une microscopie fluorescente. Jeter le milieu de croissance et fixer les cellules avec du formaldéhyde dans du PBS à température ambiante pendant 10 minutes. Remplacer l'agent de fixation par un XPBS.

Ensuite, documentez l'arrangement des cellules en prenant de cinq à dix images en champ clair de la grille choisie, en faible et en forte augmentation. Pour identifier les cellules micro-injectées, prenez des images en fluorescence aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission du colorant inerte injecté, comme l'eye. À l'aide d'un microscope confocal, collectez une pile d'images des cellules micro-injectées en forte augmentation, dans la même grille précédemment imagée.

Une forte augmentation est nécessaire afin de corréler les images fluorescentes avec les structures subcellulaires qui seront identifiées à l'aide de la microscopie électronique. Après l'imagerie confocale, utilisez un liquide d'élimination du couvre-objet pour séparer celui-ci de la boîte et placez-le, côté cellules vers le haut, dans une boîte de culture neuve contenant un XPBS. Poursuivez ensuite le traitement pour la microscopie électronique.

Suivre les protocoles standard de microscopie électronique. Pour fixer la coloration et déshydrater les échantillons, préparer de la résine épon et placer la lame couvre-objet, côté cellules vers le bas, au-dessus d'un tube rempli de résine épon. Laisser polymériser la résine à 60 degrés Celsius pendant 24 heures.

Pour retirer la lame couvre-objet de la résine épon. Plongez-la rapidement dans de l'azote liquide. Le choc thermique passe de 60 degrés Celsius à moins 196 degrés Celsius.

Détache la lame couvre-objet du tube de résine. Attendre cinq à dix minutes, puis récupérer le tube, dont la lame couvre-objet est désormais dégagée. Au microscope stéréoscopique, examiner la surface de la résine afin de localiser la grille d'intérêt.

À l’aide d’un scalpel ou d’une lame de rasoir stérile, tailler le bloc d’époxyde de manière à ce que seul le réseau d’intérêt se trouve à l’apex du bloc ; couper des sections séries de ce bloc taillé à l’aide d’un ultramicrotome. Utiliser l’acétate d’urane et le citrate de plomb pour contraster les sections selon des protocoles standards. Repérer les cellules souhaitées dans le microscope électronique en se guidant par la position relative des cellules, à l’aide des images fluorescentes haute résolution prises précédemment.

Identifier les régions d'intérêt sur la micrographie électronique qui correspondent au signal fluorescent. Utiliser des repères tels que la position de l'hétérochromatine et de l'enveloppe nucléaire pour déterminer quelle image fluorescente de Zack correspond à la coupe de microscopie électronique. À l'aide d'un logiciel d'analyse d'images tel qu'ImageJ ou Adobe Photoshop, réduire l'opacité de l'image fluorescente à 50 % et la superposer à l'image correspondante de microscopie électronique en transmission (TEM).

Alignez les images en ajustant l'échelle indiquée. Voici les résultats obtenus par microinjection et par microscopie correlative en lumière et en électrons. Cette image montre la micrographie en champ clair de cellules NRK en cours de croissance sur une lame couvre-objet gravée au laser comportant une grille en verre.

Remarquez les lettres de fond b et m utilisées pour identifier la grille contenant les cellules injectées. Les flèches indiquent les deux cellules identifiées et observées par microscopie électronique. On voit ici une image fluorescente du colorant traceur inerte cascade blue utilisé pour identifier les cellules micro-injectées.

Voici une superposition des signaux en champ clair et en fluorescence d'une petite molécule marquée par des amines. Ce panneau illustre la corrélation entre la microscopie en champ clair, la microscopie de fluorescence et la microscopie électronique d'une cellule injectée. La flèche indique des points fluorescents imagés à un grossissement plus élevé dans ce panneau.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'injecter microscopiquement une protéine d'intérêt et de suivre les modifications morphologiques subcellulaires qu'elle induit, en utilisant la procédure de microinjection Clem ou la microscopie correlative en lumière et en électrons.