Photostimulation motifs avec les périphériques numériques Micromirror chargé d'enquêter sur l'intégration à travers des points dendritiques Direction

L'objectif général de cette procédure est de contrôler des motifs complexes de lumière dans le temps et l'espace afin de pouvoir stimuler des neurones. Cela est réalisé en positionnant d'abord une puce DMD sur un plan d'image conjugué approprié dans le trajet optique du microscope. La deuxième étape de la procédure consiste à éclairer correctement le DMD à l'aide d'une source lumineuse intense, telle qu'un laser.

La troisième étape de la procédure consiste à éliminer l'effet de granulation de l'illumination cohérente. La dernière étape de la procédure est d'intégrer une interface graphique utilisateur afin de piloter la puce DMD. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent que des expériences auparavant difficiles à réaliser peuvent désormais être menées relativement facilement grâce à la lyse multilocalisée de neurotransmetteurs piégés utilisant le système DMD.

Bonjour, je suis Michael Mohammed et le laboratoire du Dr. Chaman Tang au Département de neurologie de l'Université du Maryland. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de générer des motifs complexes d'élimination dans un microscope optique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'intégration dendritique.

Commençons. Ce protocole démontrera le fonctionnement d'un dispositif numérique de micro-miroirs, ou système d'illumination DMD, pour les neurosciences expérimentales. Un DMD est une puce semi-conductrice optique comportant plusieurs centaines de milliers de micro-miroirs mobiles disposés en une matrice rectangulaire. À sa surface, la position de chaque miroir correspond à un pixel d'image.

Chaque miroir peut être contrôlé individuellement pour s'incliner entre deux orientations. Dans l'orientation éteinte, la lumière est dirigée loin de l'axe optique de l'illumination de l'échantillon. Dans l'orientation allumée, la lumière est dirigée le long de l'axe optique.

Le DMD est très adapté à la lyse car il tolère des lumières UV très intenses, génère des rapports de contraste élevés entre les pixels activés et désactivés, et peut commuter entre ces deux états en quelques dizaines de microsecondes. L'utilisation des DMD en recherche biomédicale est facilitée par l'usage répandu de logiciels et de matériels de manipulation d'images, ainsi que par l'intérêt commercial dans le domaine de l'affichage d'images. Des composants modulaires sont commercialisés par Texas Instruments sous forme de kits de découverte DLP, qui fournissent les pilotes électroniques nécessaires pour intégrer le DMD dans un système microscopique.

Les concepts de base relatifs à l'optique de la microscopie doivent être compris. Le microscope à fluorescence moderne de base est constitué d'un trajet d'imagerie et d'un trajet d'illumination. Il comprend un objectif, un cube de filtres, et deux lentilles tubulaires distinctes pour les trajets d'imagerie et d'illumination.

Le microscope est conçu de manière à posséder des plans conjugués au plan image de l'échantillon, de sorte que les objets au point au niveau du plan de l'échantillon apparaissent également au point sur ces plans d'image conjugués. Une conséquence de ce principe est qu'une image lumineuse créée sur un plan d'image conjugué se projette également de façon nette sur le plan image de l'échantillon. Cette stratégie est utilisée pour projeter un motif d'illumination généré par ordinateur sur l'échantillon.

Le faisceau laser sert de source de lumière très intense qui va illuminer le motif mis en œuvre par les micro-miroirs sur les puces DMD positionnées dans un plan image conjugué. La conception d'un système d'illumination DMD dépend des lumières d'excitation utilisées pour les expériences d'optogénétique, qui exploitent la lumière dans la gamme de longueurs d'onde visibles. Le motif illuminé peut être dirigé à travers le trajet de la caméra.

Par conséquent, la puce DMD peut simplement être montée sur l'un des deux ports caméra d'un module à double port caméra. En revanche, pour les expériences utilisant la lumière dans la gamme UV, comme la lyse de composés piégés, la lumière doit être acheminée par le chemin d'illumination épi et un plan d'image conjugué plus accessible doit être créé. Cela s'explique par le fait que l'objectif tube d'imagerie n'est pas conçu pour la transmission UV.

Plutôt, l'objectif d'éclairage est utilisé pour la transmission UV et assure correctement la formation de l'image. Chaque micro-miroir du DMD peut basculer entre une inclinaison positive et négative de 12 degrés par rapport au plan de la puce. Selon l'entrée numérique qu'il reçoit depuis l'ordinateur, l'axe de rotation suit les coins diagonaux de chaque miroir, à 45 degrés par rapport aux côtés rectangulaires de la puce.

L'orientation de l'inclinaison du miroir est indiquée par un triangle de couleur or situé à l'un des coins de la surface avant de la puce. L'inclinaison du micro-miroir détermine l'alignement du tangage et de l'azimut du faisceau lumineux incident. Pour éclairer le DMD, configurez d'abord le tangage du faisceau d'illumination à 24 degrés par rapport à l'axe perpendiculaire de la puce DMD, puis réglez l'azimut de manière qu'il soit perpendiculaire à l'axe de rotation du miroir.

L'alignement précis du faisceau est essentiel pour un fonctionnement efficace. Pour les expériences de lyse, utilisez une source laser afin de générer le faisceau focalisable de haute intensité nécessaire à la libération rapide.

Ici, un laser à état solide pompé par diode quasi continu et triplé en fréquence de type ND est utilisé ; optez pour un laser de puissance relativement élevée, car seule une faible fraction de l'émission laser parvient réellement à l'échantillon. Lorsque vous utilisez un système DMD, injectez la sortie du laser dans une fibre multimode afin de pouvoir facilement positionner et orienter celle-ci selon l'axe approprié pour éclairer le DMD, ce qui permet de résoudre le problème de granulation provoqué par l'éclairage cohérent, en transmettant la lumière à travers la fibre optique.

La fibre est enroulée autour d'un étireur de fibre électrique Pazo qui est actionné de manière à l'osciller à environ 40 kilohertz. L'étirement microscopique de la fibre suffit à déplacer le motif de speckle de nombreuses fois pendant la durée d'une milliseconde de chaque impulsion de stimulation lumineuse, éliminant ainsi efficacement le speckle. Enfin, la sortie de la fibre optique est collimatée à l'aide d'un objectif de microscope UV afin d'illuminer les DMD ; un logiciel d'image permettant de corréler les pixels du CCD aux miroirs individuels des DMD a été écrit.

L'interface graphique utilisateur du logiciel permet à l'utilisateur d'attribuer l'orientation du miroir DMD correspondant à la région de l'image CCD à l'aide de la souris d'ordinateur via l'interface graphique. Marquez l'emplacement pour la photo-stimulation en déplaçant le curseur sur l'image affichée à l'écran et cliquez sur la région d'intérêt marquée pour programmer le stockage des motifs de délivrance de lumière. Le motif indiqué à l'écran d'ordinateur sous forme d'une série d'images distinctes programme dans le logiciel la chronologie des impulsions laser pour chaque motif spatial.

Cela s'intégrera au programme d'acquisition de données P clamp. Enfin, utilisez le programme d'acquisition de données pour synchroniser le fonctionnement électronique du DMD, la temporisation du laser et l'acquisition du signal électrique enregistré en configuration de patch-clamp provenant du neurone cible. Ici, une calibration de la résolution du système optique est présentée.

La taille minimale du spot est indiquée telle qu'elle a été mesurée à partir d'une cible fluorescente. La résolution physiologique effective est déterminée par l'amplitude du courant mesurée en fonction de la stimulation lumineuse. Ici, la position du spot correspond à une stimulation lumineuse effectuée à proximité d'une branche dendritique d'un diamètre de deux micromètres à l'aide de glutamate piégé.

Tandis que le spot était déplacé, des réponses électriques orthogonales à la photo-stimulation d'intensités différentes sont illustrées. Les réponses enregistrées en régime de blocage de tension en fonction de l'intensité de lyse sont présentées.

La stimulation dendritique distribuée peut être facilement mise en œuvre à l'aide d'un système basé sur un DMD. Ici, l'intensité du stimulus était modulée en augmentant le nombre de points de stimulation lumineuse, indiqués par des cercles sur les deux branches dendritiques. La sommation spatiale peut être non linéaire au niveau des points de branchement.

Il devient de plus en plus supra-linéaire avec l'augmentation des amplitudes d'entrée arrivant sur les deux branches en provenance des portes. Ces résultats illustrent clairement la manière non linéaire de la sommation aux points de branchement dendritiques. La supra-linéarité est principalement médiée par les récepteurs NMDA et non par les canaux activés par le voltage.

Cela peut être démontré par l'application de deux antagonistes du NMDA, PV et MK-801, qui éliminent largement le comportement non linéaire. Nous venons de vous présenter la conception et le fonctionnement de base d'un système basé sur DMD pour la photo-stimulation de tissu neural selon un motif. Le système peut être adapté pour une stimulation par lumière visible, comme celle utilisée dans les expériences d'optogénétique.

Il peut également être adapté aux lumières proches du proche ultraviolet utilisées pour la lyse à un seul photon. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que si une lumière de longueur d'onde inférieure à 400 nanomètres doit être utilisée et que la plupart des utilisateurs passent par le chemin d'illumination épi, un alignement précis du faisceau d'illumination à quelques degrés près est essentiel, et que si une lumière cohérente est utilisée, les tavelures doivent être efficacement éliminées. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.