Enregistrement Comportement multicellulaire en

L'objectif général de l'expérience suivante est de développer un essai d'analyse cinématographique en micros timelapse peu coûteux, mais suffisamment rigoureux pour produire des résultats reproductibles et quantifiables. Cet objectif est atteint en utilisant des joints en silicone réutilisables et peu coûteux pour construire des plaques de milieu agros ou des lames de microscope. Les résultats obtenus montrent que ces complexes de plaques restent hydratés et suffisamment oxygénés pendant plus d'une semaine, quelle que soit la nature du milieu ou la concentration en agar utilisée.

En outre, comme la microcinématographie en accéléré est un processus lent, l'utilisation de huit microscopes peu coûteux permet d'accélérer l'acquisition des données. Bonjour, je suis Ryan Taylor du laboratoire du Dr Roy Welch du département de biologie de l'Université de Syracuse. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de réaliser des films en accéléré de biofilms bactériens dans notre laboratoire ; nous utiliserons cette procédure pour étudier le comportement multicellulaire des biofilms MTIs.

Commençons. Pour débuter cette procédure, mesurez la densité cellulaire d'une culture de *Occus sanus* ensemencée pendant la nuit à l'aide d'un clutimètre. Transférez un millilitre de la culture dans un tube de centrifugation de 2,5 millilitres, centrifugez pour former un culot, lavez-le et resuspendez les bactéries dans le milieu TPM, comme décrit dans le protocole écrit accompagnant. Utilisez une pipette et un vortex pour resuspendre complètement le culot, ce qui peut prendre un certain temps. Ensuite, ajoutez 0,5 gramme d'aros à 50 millilitres de milieu TPM, qui constitue le milieu d'essai.

Ajouter également 0,5 gramme d'aros à 50 millilitres de C-T-T-Y-E, c'est-à-dire le milieu nutritif en disque, puis stériliser au moyen d'un autoclave. Ensuite, maintenir le milieu à 55 degrés Celsius dans un incubateur ou un bain-marie, pendant la préparation du test de suivi.

Les complexes de plaques passent à la construction du disque nutritif au premier stérilisateur à flamme en verre au microscope. Faites glisser et placez un joint en caoutchouc de silicone stérile d'une épaisseur de 0,5 millimètre sur la lame. Ajoutez environ 300 microlitres de milieu C TT YE en aérosol dans la cavité formée par le joint sur la lame.

Le milieu C-T-T-Y-E agro doit être en tas ; stérilisez une autre lame et posez-la en biais sur le milieu C-T-T-Y-E agro. Placer la lame en biais empêche la formation de bulles. Une fois la lame en place, fixez l'ensemble avec de petites pinces à levier, une de chaque côté.

Placer le complexe coupé à quatre degrés Celsius et laisser durcir l'agarose au milieu C-T-T-Y-E. Cela prend généralement environ cinq minutes. Une fois l'agarose solidifié, on peut préparer les complexes de plaque utilisés dans le test de suivi.

Commencez par préparer les lames pour la construction des complexes d'essai. Pour chaque complexe, stérilisez deux lames de microscope en verre à la flamme. Placez un joint d'autoclave sur l'une des lames afin de former le fond de l'essai.

L'autre lame sert à aplatir les agros et fait office de lame support. Le dessus du test est constitué d'une lamelle. Enveloppez d'abord une lame de microscope avec du ruban adhésif pour étiqueter, puis stérilisez la lamelle en verre à la flamme et placez-la au-dessus de la lame enveloppée et stérilisée.

Faites glisser vers le haut les supports de lame pour maintenir le coverslip, en l'empêchant de se fissurer. Placez un joint d'autoclave sur le coverslip stérilisé à la flamme à l'aide de pinces. Appuyez fermement sur les joints situés sur la lame inférieure et sur le coverslip afin de vous assurer qu'ils forment un joint étanche avec le verre.

Sinon, les milieux des réseaux risquent de sécher. Mettez de côté le joint de lame et les ensembles de joint de lamelle avec les faces stérilisées vers le haut ; à partir de maintenant, travaillez toujours sur un seul complexe à la fois afin d'éviter que les milieux agarosés ne solidifient, ce qui nuirait à la qualité de l'enregistrement. Commencez par placer le disque nutritif.

Retirer le complexe de disque nutritif de quatre degrés Celsius. Enlever le bind eclipse et séparer préalablement les lames afin d'exposer les aros C-T-T-Y-E désormais solidifiés, en utilisant une pipette de prélèvement microscopique équipée d'une pointe en verre jetable de 100 microlitres. Prélever un disque nutritif d'un millimètre de diamètre dans le milieu C-T-T-Y-E agro et le placer dans la cavité créée par le joint sur la lamelle.

Ensuite, retirez les aros de milieu TPM de l'incubateur et pipetez 300 microlitres dans le puits créé par le joint sur la lame et contenant le disque nutritif. Les aros de milieu TPM doivent s'élever pour aplanir les aros de milieu T-P-M-S-A. Placez l'une des lames stérilisées à la flamme, sans joint, en biais au-dessus des aros de milieu TPM. Placer la lame en biais aide à prévenir la formation de bulles.

Fixez le complexe avec des trombones miniatures, un de chaque côté. Placez le complexe ainsi fixé à quatre degrés Celsius et laissez le milieu s'émulsionner. Cela prend généralement environ cinq minutes.

Une fois que le milieu a pris, retirez le complexe de quatre degrés Celsius. Retirez les pinces agrafes et pressez l'extrémité du complexe. Pour desserrer la lame enroulée dans du ruban adhésif, retirez la lame enroulée dans du ruban adhésif et placez-la sur la paillasse en prévision d'une utilisation ultérieure.

Ensuite, à l’aide d’une paire de forceps utilisée comme coin, séparez le complexe lamelle-joint-gel d’agarose de la lame porteuse et jetez la lame porteuse. N’utilisez pas un mouvement de levier pour séparer le complexe lamelle-joint, car cela pourrait entraîner la rupture de la lamelle ou l’adhérence du gel d’agarose à la lame porteuse.

Après avoir retiré la lame support, placez le dispositif complexe comprenant la lame, le joint et le milieu sur la lame entourée de ruban adhésif, avec le côté du joint orienté vers le haut. Placez ce complexe à côté d'un bec Bunsen afin que toute l'humidité visible s'évapore de la surface nouvellement exposée du milieu d'agar. Ne laissez pas le milieu d'agar sécher plus d'une minute.

Étant donné que cela pourrait affecter le comportement grégaire de M Zant, procédez au dépôt des cellules sur le complexe d'essai fraîchement préparé. Une fois l'excès d'humidité évaporé à partir du milieu du complexe en gélose avec lame, aspirez 0,5 microlitre des cellules concentrées afin de les déposer sur le milieu. Appuyez sur le piston de la pipette avant de vous approcher du complexe en gélose.

Une goutte de cellules apparaît au bas de la pointe de la pipette, ce qui facilite le dépôt des cellules sans que la pointe ne touche l'agarose. Une dépression à la surface de l'agarose peut modifier le comportement du mz du swarm. Abaissez la pipette verticalement pour délivrer les cellules à environ un millimètre du disque nutritif incorporé.

Ensuite, retirez la pipette en la tirant directement vers le haut. De cette manière, on s'assure que l'essaim est circulaire. Une fois les cellules déposées, placez la boîte près du bec Bunsen pour laisser sécher la goutte de cellules pendant au plus 20 secondes.

Après séchage, alignez l'ensemble joint de lame formant le fond du complexe avec le joint du couvercle. Glissez le milieu du joint acro cellulaire formant le sommet du complexe. Appuyez doucement pour former un joint étanche.

Nettoyez les surfaces de la lame et de la lamelle avec un essuie-tout pour éliminer tout résidu afin d'éviter la condensation. Placez immédiatement le montage sur la platine chauffante du microscope après le nettoyage, la lame vers le bas et la lamelle vers le haut. Si de la condensation s'est formée, laissez reposer le montage sur la platine chauffante pendant plusieurs secondes avant de lancer le logiciel d'acquisition d'images.

Pour préparer le film, choisissez l'objectif approprié, deux x quatre x ou 10 x, sur le microscope. Allumez la caméra et le microscope, puis vérifiez les niveaux de lumière afin de vous assurer que celle-ci n'est pas trop intense. Démarrez l'ordinateur et ouvrez le logiciel d'acquisition d'images.

Cliquez sur la fenêtre de l'image en direct et mettez au point le microscope. L'image apparaît similaire à celle montrée ici. Commencez à acquérir les images.

Veillez à vérifier régulièrement la mise au point pendant la première heure, car l'agarose du milieu a tendance à se tasser, ce qui provoque une dérive de la mise au point. Une fois l'acquisition des images terminée, transférez les images acquises pour stockage. Démontez le dispositif porte-lame en le faisant tremper dans de l'éthanol à 90 % toute une nuit ou nettoyez les joints avec du TOLA en vue d'une réutilisation.

Ce film accéléré montre des embryons soumis au test de suivi décrit ici. La fréquence de capture est d'une image par minute à un grossissement de 20 x ; la vitesse de lecture est de 60 images par seconde. Ce film accéléré montre une population de fourmis dont les cellules expriment la GFP dans 1 % des cellules.

Le film a été réalisé en fusionnant des images alternées de contraste de phase et de fluorescence. Le test a été effectué sur C-T-T-Y-E dans 1 % d'Aros avec une fréquence de capture d'une image par minute à un grossissement de 100 x. Ce film en accéléré montre la mobilité glissante de M Anthes.

Cet essai a été réalisé sur C-T-T-Y-E dans 1 % d'Aros. Le taux de capture est d'une image par minute à un grossissement de 100 x. Ce film en accéléré montre la motilité par soubresauts de P OSA. Cet essai a été réalisé sur LB dans 1 % d'Aros. Le taux de capture est d'une image par minute.

À un grossissement de 20 x, la vitesse de lecture est de 60 images par seconde. Ce film accéléré montre la mobilité en essaim de Smar. Cet essai a été réalisé sur LB et 1 % d'agar ; la fréquence de capture est d'une image par minute.

Avec un grossissement de 20 x, la fréquence de lecture est de 60 images par seconde. Ce film accéléré montre la motilité par glissement EGT. Cet essai a été réalisé sur LB avec 0,5 % de Tag ; la fréquence d'acquisition est d'une image par minute, tandis qu'avec un grossissement de 20 x, la fréquence de lecture est de 120 images par seconde en raison de la fragilité du milieu contenant 0,5 % d'arose dans lv.

Cet essai utilise les joints plus grands visibles dans la figure un B. Nous venons de vous montrer comment générer des films en accéléré de biofilms bactériens. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de vous rappeler de prendre votre temps et d'être aussi précis que possible afin d'obtenir des résultats cohérents.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.