Analyse quantitative des migrations au hasard des cellules en utilisant la microscopie vidéo time-lapse

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer quantitativement la migration cellulaire en temps réel à l'aide de la microscopie vidéo en laps de temps. Cette approche consiste d'abord à recouvrir une plaque de culture à six puits avec du collagène, puis à semer de manière dispersée les cellules d'intérêt sur la plaque recouverte. Dans un deuxième temps, une blessure est créée dans la plaque à l'aide d'une pointe de pipette, en veillant à laisser un espace suffisant pour la migration.

Ensuite, le microscope est mis en place et des images sont capturées à intervalles réguliers à l’aide d’un système de contrôle de température afin de permettre une surveillance continue en temps réel des cellules en migration. Enfin, le protocole de suivi de particules est utilisé pour évaluer les différences de vitesse moyenne et de déplacement total entre les cellules test et les cellules témoins. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le test de migration en chambre d’évitement, est qu’elle ne repose pas sur des mesures quantitatives de migration effectuées à un point final.

Au contraire, elle permet de surveiller et de calculer en continu différents paramètres. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du cancer, comme par exemple comment certains gènes ou médicaments influencent-ils la migration des cellules tumorales ? Deux jours avant la procédure, ajoutez 1,5 millilitre de collagène dilué dans du milieu opti à chaque puits d'une plaque de culture à six puits, puis incubez la plaque toute la nuit à quatre degrés Celsius un jour avant la procédure.

Resuspendre les cellules d'intérêt dans deux millilitres de DMEM supplémenté de FBS par puits et transférer les cellules dans chaque puits d'une plaque revêtue de collage ENC, puis incuber les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le jour de la procédure, utiliser une pipette pour créer une blessure dans les cellules cultivées pendant la nuit et laver chaque puits avec du PBS afin d'éliminer tous les débris formés suite à la blessure.

Ajouter du DMEM complété avec du FBS dans les puits rincés, puis examiner au microscope afin de confirmer qu’un espace de blessure propre a été créé. Après avoir allumé la caméra du microscope et le dispositif d’imagerie en temps réel des cellules vivantes, positionner la plaque sur la platine du microscope. Recouvrir la plaque avec la nouvelle chambre de contrôle environnemental pour cellules vivantes, régler le thermostat à 37 degrés Celsius et la concentration de dioxyde de carbone à 5 %. Ouvrir maintenant le logiciel SlideBook dans la barre de menu.

Sélectionnez le contrôle de mise au point en cliquant sur le bouton F dans un cercle. Dans la zone de l'objectif, utilisez la fenêtre déroulante pour définir l'objectif. Dans la zone du jeu de filtres, sélectionnez les paramètres permettant d'orienter le trajet de la lumière vers la pièce I. Choisissez le filtre approprié pour l'éclairage en champ clair, puis cliquez sur Ouvrir Champ Clair.

Ouvrir l'obturateur du champ clair. Sélectionner ensuite le filtre de champ clair sur la tourelle et observer l'échantillon à travers l'oculaire pour repérer les champs appropriés et mettre l'échantillon au point. Puis, déplacer la tourelle à filtres afin de rediriger le trajet de la lumière vers la caméra. Pour la capture d'images dans le logiciel slide book, cliquer sur le contrôle de mise au point, sélectionner XY pour choisir différentes positions à travers l'oculaire, puis cliquer sur « définir point » pour verrouiller chaque position.

Pour la capture d'images, régler manuellement le focus de l'image de la caméra affichée sur l'écran, puis utiliser les outils de la fenêtre de contrôle du focus pour ajuster la position Z de la platine. Pour de meilleurs résultats, effectuer la mise au point sur des prolongements cellulaires plats situés près du contact avec la plaque afin de faciliter la focalisation. Utiliser le curseur pour régler les temps d'exposition dans une plage appropriée pour la mise au point.

Si plusieurs positions XY ont été sélectionnées, ajustez le focus pour chaque position individuelle en sélectionnant la commande de focus, puis xy, puis en visitant le point. Dans le carnet de diapositives, sélectionnez l'icône de caméra dans la barre de menu, choisissez le type de capture, puis sélectionnez lapse de temps pour définir la durée de l'expérience.

Dans le menu déroulant, saisissez le délai souhaité entre le début d'un point temporel et le début du suivant. Dans les champs d'intervalle, le troisième champ sera automatiquement calculé à partir des valeurs saisies manuellement. Sous l'acquisition multiple XY, sélectionnez la liste multipoints pour les expériences comportant plus d'une position XY.

Enfin, nommez le fichier pour l’enregistrer, allez dans le contrôle de capture et sélectionnez « avancé », puis « spool ». Capturez ensuite en mémoire et enregistrez dans le fichier spool après chaque point temporel. Commencez en cliquant sur l’image.

Dans la barre de menu du carnet de diapositives, sélectionnez l'importation dans le menu déroulant, puis cliquez sur le rouleau du carnet de diapositives. Sélectionnez les fichiers de carnet de diapositives souhaités générés à partir de l'expérience de migration pour différents champs et points de temps. Ouvrez le premier fichier, puis sélectionnez masque dans la barre de menu et choisissez le protocole de suivi de particules dans le menu déroulant.

Sous le menu de suivi des particules, choisissez le protocole de suivi manuel des particules. Une fenêtre apparaîtra avec les points temporels de début et de fin. Pour analyser la migration aléatoire, sélectionnez le masque, puis le protocole de suivi des particules. Encore une fois, pour déterminer les coordonnées du centre de l'objet, sélectionnez le centre de la surface.

Ensuite, cliquez sur « track » et continuez. Choisissez maintenant les statistiques souhaitées pour chaque trajectoire, telles que le déplacement et la vitesse moyenne. Comme indiqué ici, cliquez sur « calculate » pour afficher les statistiques.

Un exemple d'analyse de migration aléatoire quantifiée en termes de vitesse est présenté dans cette boîte. Sur le graphique en boîte à moustaches, dans cette expérience, on observe une augmentation de la vitesse moyenne chez les cellules M-D-A-M-B 2 31 présentant un gène suppresseur de tumeur inhibé. Par rapport aux cellules M-D-A-M-B 2 31 témoins représentées ici, la migration aléatoire des cellules de la première figure a été analysée en fonction du déplacement cellulaire.

Encore une fois, le groupe présentant une inhibition totale du gène suppresseur de tumeur a montré un déplacement cellulaire accru par rapport au contrôle M-D-A-M-B 2 31. Les cellules dans cette vidéo en microscopie à intervalles du contrôle MDA MB 2 31 ont été cultivées sur du collagène pendant la nuit. Les images ont ensuite été prises toutes les heures pendant une durée totale de 18 heures lors d'une migration aléatoire.

Observez comment les cellules s'éloignent de leur position initiale au fil du temps. Dans ce film, la migration de cellules M-D-A-M-B 2 31 testées après une mise en culture nocturne sur du collagène a été enregistrée et analysée. Notez que les cellules testées sont plus migratrices par rapport aux cellules témoins du film précédent.

Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'invasion cellulaire et les dynas peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme quelles sont les fonctions des cellules dans la métastase cancéreuse après leur développement ? Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer la migration cellulaire à l'aide de lignées cellulaires cancéreuses isolées.