Imagerie chronique des souris cortex visuel en utilisant une préparation Diluée-crâne

Les épines dendritiques sont des prolongements membranaires issus de la dendrite d'un neurone et qui reçoivent les entrées synaptiques. L'allongement, la réduction, l'apparition ou la disparition des épines surviennent en réponse à des modifications de la fonction du réseau neuronal résultant de schémas spécifiques d'activité neuronale. Ce phénomène est connu sous le nom de plasticité corticale, permettant d'observer les changements morphologiques des épines dendritiques.

Chez des animaux vivants, une plaque d'imagerie est fixée sur le crâne d'une souris. Une zone du crâne est amincie chirurgicalement et des images sont prises à faible et forte augmentation. Ces zones sont ensuite réimager à des points temporels ultérieurs.

Les résultats obtenus montrent que la morphologie des épines dendritiques peut être clairement visualisée à l'aide d'une préparation au crâne mince à plusieurs points temporels. Et que la morphologie des épines est hautement plastique, présentant des changements structurels ainsi que l'apparition et la disparition d'épines dendritiques. Bonjour, je suis Emily Kelly au laboratoire d'Anaya Maka, du Département de neurobiologie et d'anatomie de l'Université de Rochester.

Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure d'imagerie chronique du cortex vial de la souris après une préparation appelée crânienne. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le renouvellement des épines dendritiques. Commençons donc.

Commencez la procédure en stérilisant les outils destinés à la chirurgie aseptique. Ensuite, stérilisez l'espace de travail à l'aide d'éthanol à 70 % et recouvrez la surface opératoire d'un champ stérile. Surveillez la profondeur de l'anesthésie chez une souris anesthésiée avec un cocktail contenant du fentanyl en testant sa réponse à une pincée du orteil ; la souris illustrée ici est une souris transgénique A-G-F-P-M dans laquelle la GFP est exprimée.

Dans les cellules paramétales de la couche cinq qui projettent des prolongements dendritiques vers les couches superficielles. Pour maintenir une température corporelle de 37,5 degrés Celsius, placez l'animal sur une couverture chauffante et surveillez-le à l'aide d'un thermomètre rectal fixé. Ensuite, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter qu'ils ne s'assèchent, en utilisant des ciseaux.

Retirez les poils à l'arrière de la tête de la souris, de derrière les oreilles jusqu'aux yeux. Ensuite, nettoyez le sommet du crâne de l'animal avec une application d'éthanol à 70 %, suivie d'un brossage au Bétadine et d'une solution de Bétadine. Pratiquez une incision en forme de LCU derrière les oreilles et remontez le long du côté droit ou gauche de la ligne médiane, selon l'hémisphère qui sera imagé jusqu'aux yeux, puis repliez la peau par-dessus et loin du site chirurgical.

Ne pas retirer la peau, car elle sera suturée ultérieurement à l’aide de pinces fines. Tirer doucement la peau vers le haut et loin de la zone d’intérêt. À l’aide de pinces propres, gratter délicatement le périoste de la zone exposée du crâne.

Appliquer une petite quantité de chlorure ferrique à 10 % sur le crâne afin de sécher complètement la membrane périostée et s'assurer qu'elle a été entièrement retirée. Il est important que le crâne soit parfaitement sec. Pour garantir une bonne adhérence de la colle, gratter délicatement la membrane périostée séchée à l’aide d’une lame de microchirurgie.

Ensuite, appliquez une fine couche de colle acrylique Sano autour de la fenêtre d'imagerie de la plaque crânienne en acier inoxydable et fixez la plaque sur le crâne. À l’aide de l’extrémité en bois d’un coton-tige, appliquez la colle sur les joints intérieurs de la fenêtre d’imagerie, en veillant à combler tous les espaces entre la plaque d’imagerie et la courbure du crâne. Déposez une goutte d’accélérateur de colle dans la fenêtre.

Ensuite, essuyez rapidement l'excès. Laissez sécher la colle une fois qu'elle est complètement sèche. À l'aide d'une fraise dentaire équipée d'une fraise en acier inoxydable de 0,7 millimètre, commencez à amincir le crâne dans la fenêtre d'imagerie.

Alternez le perçage avec une application occasionnelle de sérum physiologique stérile à 0,9 % afin d'éviter de produire trop de chaleur sur le crâne. Amincissez une fenêtre de quatre millimètres sur quatre millimètres sur le crâne en effectuant de petits mouvements sur la surface osseuse.

Avec le foret dentaire. Vérifiez la finesse du crâne à l’aide de pinces à extrémité émoussée. La surface du crâne s’enfoncera légèrement sous une pression douce.

L'épaisseur optimale du crâne pour l'imagerie se situe entre 10 et 30 micromètres. Une fois le crâne aminci, nettoyer la fenêtre de toute débris et appliquer du sérum physiologique sur le crâne. Prendre une photographie de la fenêtre d'imagerie à l'aide d'un appareil photo numérique monté sur une loupe binoculaire.

Le réseau vasculaire cérébral visible sur cette photographie aidera à localiser la position où placer la plaque d'imagerie pour les séances d'imagerie ultérieures. Transportez l'animal vers le dispositif d'imagerie à deux photons. L'animal doit rester sur la couverture chauffante et sa température corporelle doit être surveillée en continu pendant toute la durée de la séance d'imagerie.

Un microscope à deux photons équipé d'un laser mi tai. Une pompe à l'état solide de 10 watts pour une puissance maximale et une unité confocale Olympus Flow View modifiée sont utilisées. Le système est optimisé pour l'imagerie en profondeur des tissus et des détecteurs externes sont installés aussi près que possible de l'objectif afin de permettre une détection maximale de la fluorescence provenant du cerveau ; ajoutez une goutte de solution saline sur la fenêtre d'imagerie en utilisant un faible zoom numérique.

Identifier une zone contenant des neurones fortement marqués à l’aide d’une caméra numérique fixée au microscope. Ensuite, prendre une photographie de la zone d’imagerie. Cette étape est nécessaire pour revenir ultérieurement au même emplacement d’imagerie à un moment donné ultérieur.

Obtenir un empilement à faible grossissement couvrant toute l'étendue visible du cerveau, montrant l'ampleur de la ramification dendritique. Cet empilement servira à localiser la zone d'imagerie lors des points temporels ultérieurs, tant pour les vaisseaux sanguins que pour les dendrites. Conserver leur structure chez les animaux jeunes et adultes à l'aide d'un logiciel d'imagerie.

Augmentez huit fois le grossissement numérique, ajustez les coordonnées XY si nécessaire, puis enregistrez un empilement à fort grossissement, qui montrera la morphologie dendritique détaillée, y compris l'emplacement et la structure des épines dendritiques. Prenez des notes détaillées pour chaque acquisition d'empilement, incluant les coordonnées de panoramique, la plage d'acquisition, la taille du pas en Z et le nombre de pas dans l'empilement. Ces notes seront utilisées lors du retour ultérieur vers cette dendrite ou cet axone à un moment ultérieur.

Après l'imagerie, retirez la plaque crânienne en la séparant délicatement de la surface du crâne. À l'aide de pinces, éliminez toute colle résiduelle et essuyez le crâne avec du sérum physiologique stérile à 0,9 %.

Refermer la peau au-dessus du crâne à l’aide d’un fil de suture n°6. Nettoyer la zone avec de l’éthanol à 70 % après la procédure d’imagerie. Placer l’animal dans une cage propre sous une lampe chauffante jusqu’à ce qu’il se réveille et retrouve sa mobilité.

Ensuite, remettez l'animal dans sa cage d'origine pour imaginer à nouveau l'animal à un moment ultérieur, allant de deux jours à plusieurs mois plus tard, retirez les points de suture et rouvrez la peau au niveau de la tête. À l'aide de méthodes aseptiques, utilisez l'image numérique de la vascularisation cérébrale prise lors de la première chirurgie pour localiser l'emplacement d'imagerie d'origine. Puis, re-fixez la plaque crânienne comme précédemment.

Utilisez une lame microchirurgicale pour éliminer délicatement tout os ayant pu repousser entre les points temporels d'imagerie, si nécessaire. Amincissez à l’aide d’un foret dentaire, nettoyez la fenêtre d’imagerie des débris et appliquez une goutte de solution saline stérile à 0,9 %. Transportez l’animal vers un microscope à deux photons et localisez la zone d’imagerie initiale à l’aide de l’image fluorescente numérique prise lors de la séance précédente.

Démarrez le programme d'analyse d'écoulement. Ouvrez l'image initiale à faible grossissement, fixez une feuille de transparence sur l'écran de l'ordinateur et esquissez le réseau des principaux vaisseaux sanguins à l'aide d'un feutre pour rétroprojecteur. Ensuite, ouvrez l'image en direct et réalignez la vascularisation sanguine sur le schéma dessiné sur la feuille de transparence.

Retirez la feuille transparente pour recapturer les images des huit structures agrandies. Ouvrez la pile souhaitée provenant de la précédente session d'imagerie. Dessinez la structure sur un film transparent fixé à l'écran de l'ordinateur.

Zoomer huit fois à partir de l’image en direct et aligner l’image avec la transparence. Selon la précision de l’alignement de l’emplacement à faible grossissement, il peut être nécessaire d’ajuster légèrement l’angle de l’image, puis régler les coordonnées de panoramique aux paramètres d’imagerie du premier jour, incluant la taille du pas et le nombre d’images à acquérir. La réimagerie Zack peut être effectuée deux fois. Le nombre d’ouvertures du cuir chevelu doit être limité afin d’éviter de compromettre l’intégrité du crâne, ce qui entraînerait une résolution d’imagerie médiocre chez les souris exprimant GFP.

Un sous-ensemble de cellules paramétales de la couche cinq et les processus dendritiques correspondants ont été visualisés à l’aide de la microscopie à balayage laser à deux photons in vivo ici ; des dendrites du cortex visuel marquées par la GFP sont montrées. Cette image est une projection d'une série d'images obtenues toutes les cinq micromètres depuis la PIA jusqu'à une profondeur finale de 175 micromètres. La région encadrée est montrée à un grossissement plus élevé ici au jour zéro, puis à nouveau au jour quatre ici, comparant des images agrandies d'une branche dendritique aux jours zéro et quatre.

Ces images montrent des épines stables, indiquées par des têtes de flèches blanches, des épines rétractées, marquées par des têtes de flèches rouges, et de nouvelles épines, indiquées par des têtes de flèches vertes. Nous venons de vous montrer comment réaliser un imaging chronique en deux photons dans le cortex visuel de la souris à l’aide d’une préparation au crâne mince. Lors de cette procédure, il est important de prendre des précautions particulières lors de l’étape d’amincissement afin d’éviter tout dommage au crâne et à la dure-mère sous-jacente, ce qui entraînerait une mauvaise résolution d’imagerie, et de prendre des notes détaillées.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.