Une procédure de chirurgie Craniotomie pour l'imagerie cérébrale chronique

Les techniques d'imagerie deviennent de plus en plus importantes dans l'étude du fonctionnement cérébral. Parmi celles-ci, la microscopie laser à deux photons s'est imposée comme une méthode extrêmement utile, car elle permet l'étude du cerveau d'une fourmi vivante et, avec des préparations appropriées, l'observation chronique de la même zone corticale pendant des durées allant de quelques minutes à plusieurs mois.

Dans cette vidéo, nous présentons une préparation destinée à l'imagerie chronique in vivo du cerveau à l'aide de deux microscopies photoniques. La préparation de fenêtre crânienne que nous allons démontrer aujourd'hui a été initialement mise au point par le Dr Carl Voda, chercheur de l'Institut Médical Howard Hughes à Janelia Farm. Salut et Ricardo Must, du laboratoire de Carlos Porter Cayo, du Département de neurologie de l'Université de Californie à Los Angeles.

Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure pour créer une fenêtre crânienne destinée à l'imagerie chronique in vivo. Cette préparation est très utile car elle permet d'observer en profondeur à l'intérieur du cerveau à l'aide d'un microscope laser à deux photons. Commençons donc.

Avant de commencer la chirurgie, les souris sont anesthésiées à l'isoflurane : 4 % pour l'induction, 1,5 à 2 % pour la chirurgie, selon des procédures approuvées par l'IACUC. Il est important d'utiliser des pinçures de la queue ou des orteils afin de s'assurer que l'animal est complètement sédéé. À l'aide d'un tondeur pour rongeurs, les poils de l'arrière du cou jusqu'aux yeux sont rasés.

Après le rasage, la souris est placée sur un cadre stéréotaxique, posée sur une couverture à circulation d'eau réglée à 37 degrés Celsius, et la tête est fermement fixée à l'aide de barres auriculaires. Une pommade oculaire est ensuite appliquée afin d'empêcher les yeux de l'animal de se dessécher. Ensuite, de la dexaméthasone, 0,2 milligramme par kilogramme, et du carprofène, 5 milligrammes par kilogramme, sont administrés par voie sous-cutanée.

Afin d'éviter respectivement un gonflement du cerveau ou une réponse inflammatoire. Avant de commencer la chirurgie, assurez-vous de stériliser la zone opératoire en essuyant la peau avec trois tampons alternés d'alcool à 70 % et de Bétadine. Tous les instruments chirurgicaux ont été préalablement stérilisés à l'aide d'un stérilisateur à billes de verre, en utilisant des ciseaux qui ont été pulvérisés avec de l'éthanol.

La peau recouvrant le sommet du crâne est retirée, en commençant par une incision horizontale le long de la base de la tête, suivie de deux incisions en direction rostrale, atteignant presque les paupières. Puis deux incisions obliques qui convergent vers la ligne médiane. À ce stade, une goutte de solution de lidocaïne et d'épinéphrine est appliquée sur le périoste pour éviter un saignement excessif ou des douleurs ; avec un scalpel, le périoste est rétracté vers les bords du crâne.

Les muscles du dos du cou sont également légèrement rétractés. Toute la surface exposée du crâne est ensuite grattée délicatement avec un scalpel afin d'obtenir une surface sèche. Cette étape est très importante car elle permettra à la colle d'adhérer plus efficacement lorsqu'elle sera appliquée ultérieurement.

Une fois le site d'imagerie choisi, on peut procéder à la création de la fenêtre crânienne. Un cercle d'environ quatre millimètres de diamètre est délicatement tracé à l'aide d'une fraise dentaire pneumatique. Après un léger perçage, une solution de lidocaïne à l'épinéphrine est à nouveau appliquée sur la surface du crâne.

Le perçage s'arrête lorsqu'il reste une couche très fine d'os, généralement d'une épaisseur d'un seul nez. Ce stade est atteint en exerçant une pression douce au centre de la craniotomie pour sentir comment elle cède sous une goutte de sérum physiologique, en profitant de la structure en trame osseuse. Une structure osseuse spongieuse.

La craniotomie est soulevée du crâne à l’aide de pinces à extrémité très fine. La solution saline est importante car elle aide à soulever le crâne et à prévenir les saignements de la dure-mère. Ensuite, un tampon de gel mousse préalablement imbibé de solution saline est appliqué sur la dure-mère afin d’arrêter tout petit saignement qui peut parfois survenir lors du retrait du crâne.

Après avoir séché la surface de la dure-mère et vérifié l'absence de saignement, un lamelle stérile de cinq millimètres de verre est déposée délicatement sur la dure-mère. Une goutte de colle à base de cyanoacrylate est appliquée sur l'hémisphère opposé du crâne. À l'aide d'une aiguille, la colle est répartie doucement tout autour de la fenêtre, en prenant soin de ne pas en mettre sous le verre.

La colle peut maintenant être appliquée en une fine couche sur toute la surface du crâne. Une fois la colle sèche, de l'acrylique dentaire est mélangé et appliqué sur l'ensemble de la surface du crâne, en recouvrant également un petit rebord de la lamelle afin de la fixer. Après avoir fixé la lamelle, un petit puits est formé autour de la fenêtre à l’aide d’acrylique dentaire.

Une barre en titane est également intégrée dans l'acrylique dentaire. Cette barre servira ultérieurement à fixer la souris solidement sur la platine du microscope. Pour l'imagerie, il est important de s'assurer que la barre est de niveau afin qu'elle soit parallèle à une fenêtre crânienne.

Placer une feuille de papier sous la barre permet de maintenir celle-ci à l'horizontale pendant que l'acrylique durcit ; on laisse l'acrylique dentaire polymériser ou durcir pendant 10 minutes, au bout desquelles la barre en titane est solidement fixée. L'animal est ensuite placé dans une cage chauffée jusqu'à son réveil. Après le réveil de l'anesthésie, l'animal peut être soumis à un examen d'imagerie le jour même.

Ce film montre un empilement de 160 images prises à des intervalles de cinq microns à l’aide de notre microscope à deux photons sur mesure à travers une fenêtre crânienne placée au-dessus du cortex somatosensoriel d’un souris GFPM âgée de trois mois. Cette lignée transgénique de souris exprime la GFP dans un petit sous-ensemble de neurones pariétaux. Dans la couche cinq et la couche deux-trois, l’image a été prise avec un objectif à immersion dans l’eau de 40 x et une ouverture numérique de 0,8, en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 910 nanomètres.

Dans les images les plus superficielles, il est facile de reconnaître les arborisations dendritiques des dendrites apicales des cellules paramétales. Le bouquet apical des dendrites de chaque neurone converge vers une unique dendrite apicale importante. De plus petites dendrites obliques peuvent également être observées émanant de cette dendrite apicale principale ; des axones traversant le champ de vision sont également visibles.

Ceci est un empilement de 12 images prises tous les un micromètre et demi, à l’aide du même objectif 40 x à fort grossissement, montrant un dendrite superficiel à une résolution suffisamment élevée pour distinguer les épines dendritiques individuelles. Nous venons de vous montrer comment réaliser une fenêtre crânienne pour l’imagerie chronique du cerveau en microscopie photonique. Cette méthode est extrêmement puissante pour l’étude du cerveau, car elle permet d’analyser à la fois la structure et la fonction du cerveau vivant, non seulement lors d’une seule séance d’imagerie, mais aussi de manière chronique, au cours de multiples séances répétées sur plusieurs mois.

Un autre avantage de la préparation de la fenêtre crânienne est qu'elle permet d'obtenir un grand champ de vision, ce qui rend possible l'imagerie de structures étendues, telles qu'une aire cérébrale entière ou l'arborisation dendritique sur plusieurs millimètres. Lors de cette procédure, il est important de toujours travailler dans des conditions aussi propres et stériles que possible, et de disposer d'une main très stable. Voilà, c'est tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.