Pseudofracture: Un modèle périphérique aiguë traumatisme tissulaire

Lorsqu'un os long, comme un fémur ou un tibia, est fracturé, le muscle lésé et les tissus mous sont exposés à des fragments osseux endommagés et à la moelle osseuse. Ceci est suivi d'une réponse immunitaire intense visant à favoriser la réparation des tissus. Un modèle permettant d'étudier les effets de cette exposition peut être obtenu en prélevant à la fois les fémurs et les tibias.

À partir d'une souris donneuse. Les os sont broyés pour créer une solution osseuse, qui est ensuite injectée dans la cuisse lésée d'une souris receveuse. Les réponses immunitaires sont ensuite surveillées et les lésions d'organes distants évaluées afin d'étudier les effets à long terme du traumatisme induit par la fracture.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes de traumatisme tissulaire périphérique, comme le modèle de fracture bilatérale du fémur, est que ce modèle, appelé modèle de pseudo-fracture, permet une survie à long terme sans complications dues à une anesthésie prolongée ou à des techniques complexes de fixation de fracture, et permet ainsi l'étude des réponses immunitaires à long terme après le traumatisme. Avant de commencer la procédure, préparez les fournitures suivantes : un seau à glace, du Betadine, des instruments chirurgicaux, des pinces hémostatiques GRE, un mortier et un pilon, des pinces, des aiguilles de calibre 20, une seringue d'un cm³, du PBS pour l'anesthésie et un embout nasal à isoflurane. Un seul animal euthanasié, apparié par âge et poids.

La souris donneuse doit fournir suffisamment de matériel pour trois receveuses. Fixez la donneuse sur une planche en plexiglas, en veillant à n’attacher les membres inférieurs qu’au niveau de l’extrémité des pieds. Rasez soigneusement les membres inférieurs.

Ensuite, les recouvrir complètement de Bétadine et d'alcool pour assurer l'asepsie, retirer les os longs de l'extrémité inférieure, pratiquer une incision chirurgicale dans la peau au niveau de la région inguinale, puis poursuivre la section de la peau sur toute la longueur de l'extrémité jusqu'à la cheville, rétracter la peau et la disséquer de l'aponévrose sous-cutanée et des muscles, tant sur les aspects médial que latéral. Insérer ensuite une lame des ciseaux sous les muscles situés en avant et sur le côté du tibia. Faire glisser la lame proximalement et distalement afin de soulever proprement les muscles de l'os sous-jacent.

Répétez cette technique sur la face postérieure et médiale inférieure du tibia afin de séparer les muscles situés sous le tibia. Un effort minimal supplémentaire doit être appliqué sur le côté postérieur lors du déplacement vers le bas, afin de briser la fibula loin du tibia à l'extrémité proximale de ces muscles de la jambe. Coupez les tendons aussi près que possible de leurs insertions et écartez les muscles vers le bas tout en tirant sur le groupe musculaire dans son ensemble ; en tirant vers le bas, une légère traction permettra de libérer les insertions distales de l'articulation de la cheville, en coupant à l’aide de ciseaux à travers l’articulation de la cheville.

Ne pas détacher le tibia du fémur à ce stade, cette connexion procure un levier supplémentaire qui facilitera la dissection du fémur à partir de l'articulation de la hanche. Utiliser une technique similaire pour libérer les muscles du fémur. Effectuer cette manipulation postérieurement et, si nécessaire, aussi bien médialement que latéralement.

Coupez l'insertion distale de ces groupes musculaires pour les libérer de l'articulation du genou. Prolongez l'incision cutanée selon les besoins afin d'obtenir une exposition adéquate et suivez en dessous des muscles. Pour disséquer l'extrémité du fémur hors de l'articulation de la hanche, retirez le fémur et le tibia attaché de la souris donneur et placez-les sur une compresse stérile.

Séparez les deux os au niveau de l'articulation du genou en saisissant simplement chaque os d'une main différente et en tournant doucement ou en faisant pivoter les deux os dans des directions opposées le long de leurs axes longitudinaux. Pour éliminer les attaches tendineuses restantes sur les os longs, enroulez un morceau de gaze de quatre par quatre autour de la longueur de l'os. Serrez fermement et grattez toute la longueur des os plusieurs fois afin d'éliminer les tissus résiduels présents à la surface.

Placer les os collectés dans un tube microfuge stérile de 1,5 millilitre sur de la glace. Transporter les os du donneur vers une cabine de sécurité biologique soigneusement désinfectée. Pour la préparation de la solution osseuse.

La hotte doit être préparée avec un champ stérile, un mortier et un pilon stériles, une paire de forceps stérile, un tube stérile de huit millilitres, du PBSA stérile, une pipette d'un millilitre avec des embouts de pipette respectifs. Un pipeteur de 100 microlitres avec ses embouts respectifs, des seringues d'un millilitre et des aiguilles de calibre 20. À l’aide du forceps, transférez les os dans le mortier et utilisez le pilon pour broyer délicatement les os. Pipetez un millilitre de PBS dans le mortier et continuez à broyer les fragments restants en effectuant des mouvements circulaires afin d’assurer une suspension complète.

Ensuite, ajoutez un autre millilitre de PBS et continuez à broyer afin d'obtenir une solution osseuse, qui doit présenter une teinte rose. Versez lentement la solution du mortier dans le tube de huit millilitres en veillant à ce que les éventuels résidus plus gros restent dans le mortier. Transférez la solution osseuse dans une seringue d'un millilitre.

Avec une aiguille de 20 gauge, la solution osseuse doit rester sur glace. Prélevez un microlitre de la solution osseuse à l’aide d’une pipette et déposez-le sur une boîte de Mac congar en répartissant uniformément sur la surface. Incubez la boîte pendant 24 à 48 heures afin de garantir la stérilité.

Commencez la procédure chirurgicale pour une lésion des tissus mous et une injection de solution osseuse en évaluant la profondeur de l'anesthésie d'une souris anesthésiée au pentobarbital par une pincée du orteil. Placez la souris en position dorsale sur une planche en plexiglas et immobilisez l'animal en enroulant légèrement des bandes fines de ruban adhésif, côté collant vers l'extérieur, autour de la partie distale de chaque membre à l'aide d'une tondeuse Oscar cinq avec une lame de taille 40. Rasez les régions abdominale, inguinale et fémorale de l'animal.

Transférez la souris dans le champ chirurgical stérile. Nettoyez la zone chirurgicale avec du Bétadine. Ensuite, essuyez avec de l’alcool pour la stériliser.

Placer un cône nasal sur la souris contenant un morceau de gaze imbibé d’un millilitre d’isoflurane à 99 %. Une fois que la respiration de l’animal commence à ralentir, retirer le cône nasal. Si une anesthésie supplémentaire est nécessaire pendant une partie de la procédure, une injection supplémentaire de pentobarbital peut être administrée ou de l’isoflurane peut être fourni.

Ensuite, prenez un pansement stérile et étendez-le sur la souris de manière à ne laisser exposées que les extrémités inférieures et la tête. Cette lésion des tissus mous correspond à une blessure par écrasement bilatérale des membres postérieurs. Veillez à ce que la souris soit positionnée avec les membres postérieurs légèrement en abduction et en rotation latérale.

Cela facilite l'accès au muscle correct. Regrouper les fléchisseurs du genou pour réaliser la lésion par écrasement. Placer un gros clamp hémostatique de 18 centimètres autour du point médian de la musculature postérieure de la cuisse, le long du fémur, avec sa courbure convexe tournée vers le fémur. Verrouiller le clamp hémostatique en le fermant jusqu'au premier cran uniquement, pendant 30 secondes.

Insérez l'aiguille à travers la peau de deux à trois millimètres, le bord de la rampe touchant juste le fémur. Injectez 0,15 millilitre de la solution osseuse dans le muscle fémoral broyé de chaque côté. Retirez l'aiguille et placez rapidement un doigt ganté stérile sur le site d'injection pour éviter tout reflux de la solution osseuse hors de la plaie.

Conserver ce doigt en place pendant plusieurs secondes. Remettre la souris dans la cage et lui permettre une liberté de mouvement complète dès que l'anesthésie se dissipe. Une gestion adéquate de la douleur doit être administrée lorsque la souris reprend conscience.

Ce schéma général illustre la réponse immunitaire biphasique suivant un traumatisme au moment zéro. Un traumatisme est induit. Celui-ci est suivi d'une réponse hyperinflammatoire précoce qui atteint un pic à six heures et est mesurée par l'évaluation de l'inflammation systémique et du dysfonctionnement d'organes distants.

La deuxième composante de la réponse immunitaire post-traumatique est une immunosuppression retardée, mesurée par une dysfonction des cellules immunitaires, et représentée sous forme de creux vers 48 heures. Il s'agit d'un schéma représentatif de la réponse en cytokines inflammatoires dans le plasma, survenant précocement après un traumatisme, et constituant un exemple d'inflammation systémique. Une dysfonction d'organes à distance, évaluée par l'atteinte hépatique, est observée élevée dans un délai similaire.

Ce schéma représentatif illustre un exemple de dysfonctionnement des cellules immunitaires survenant tardivement après un traumatisme. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de veiller à maintenir l’asepsie et à effectuer des manipulations précises tout au long de l’expérience. Ce modèle ne reproduit ni une fracture authentique ni une infection de plaie.