Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant l'acrylamide basée hydrogels

Pour modéliser la compliance tissulaire in vivo à l'aide d'hydrogels d'acrylamide. Cette approche est réalisée en premier lieu en générant des lamelles inférieures réactives et des lamelles supérieures silanisées. La deuxième étape de la procédure consiste à verser et former les hydrogels d'acrylamide.

La troisième étape de la procédure consiste à réticuler la protéine de matrice extracellulaire choisie au sein de l'hydrogel. La dernière étape de la procédure est l'incubation et l'analyse des cellules. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant comment la compliance variable de la matrice extracellulaire in vitro régule le comportement cellulaire par des analyses réalisées au moyen de microscopie d'immunofluorescence, de PCR quantitative en temps réel et de western blotting.

Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure de fabrication et d'utilisation des hydrogels d'acrylamide. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier comment la rigidité de la matrice extracellulaire régule la morphologie cellulaire, la signalisation cellulaire et la prolifération. Commençons donc.

Commencez cette procédure en préparant des lamelles réactives. Placez d'abord une couche de parafilm sur la moitié inférieure d'une boîte de Pétri de 150 millimètres. Transférez ensuite jusqu'à neuf lamelles de 25 millimètres stérilisées à l'autoclave sur le parafilm et recouvrez-les d'un millilitre de soude à 0,1 molaire.

Incuber les lamelles pendant trois minutes. Après l'incubation, aspirer l'hydroxyde de sodium à l'aide d'une ligne sous vide en travaillant sous hotte chimique, puis pipeter 0,5 millilitre de triméthylsilylpropylamine ou 3-A-P-T-M-S sur chaque lamelle. Incuber les lamelles pendant trois minutes, puis aspirer le 3-A-P-T-M-S. Prendre garde de ne pas prolonger l'incubation afin d'éviter la formation d'écume sur la lamelle.

Préparations après traitement. Rincer les lamelles une fois avec 20 millilitres d'eau déionisée dans le même plat. Retirer les lamelles du plat à l'aide de pinces courbes et les transférer, côté traité vers le haut, dans un nouveau plat de 150 millimètres.

Ensuite, lavez à nouveau les lamelles avec de l'eau déionisée et placez-les sur l'agitateurbasculant pendant 10 minutes. Après l'incubation, retirez l'eau et effectuez deux lavages supplémentaires. Il est très important d'éliminer complètement le A-P-T-M-S afin qu'il ne réagisse pas avec le glutaraldéhyde et ne forme pas de précipité blanc trouble 10 minutes avant l'utilisation du glutaraldéhyde.

À l’aide de pinces courbes, transférer les lamelles dans une boîte propre recouverte de paraffine et aspirer tout liquide résiduel à l’aide d’une ligne sous vide. Recouvrir ensuite complètement chaque lamelle de 0,5 millilitre de glutaraldéhyde à 0,5 % dans de l’eau stérile déionisée afin de réticuler les trois A-P-T-M-S et le gel de polyacrylamide. Incuber les lamelles pendant 30 minutes dans une hotte chimique. Puis aspirer la solution de glutaraldéhyde et laver à nouveau les lamelles avec de l’eau déionisée.

Ensuite, séchez complètement les lamelles. Ajoutez de nouvelles lamelles dans un tube Falcon de 50 millilitres contenant une solution de scellement de surface à 10 % dans du chloroforme et agitez pendant au moins 10 minutes. Versez délicatement la solution de scellement de surface et laissez sécher à l'air.

Placer les lamelles sur des essuie-tout Kim dans la hotte de sécurité biologique où seront préparés les hydrogels, afin de commencer la préparation des hydrogels. Utiliser des pinces courbes pour transférer les lamelles, côté réactif vers le haut, sur une feuille de paraforme fixée avec du ruban adhésif à la surface de la hotte de sécurité biologique. Veiller à ce que les lamelles soient bien à plat sur la surface de la paraforme.

Préparez ensuite une solution saturée d'aide CIN hydroxy ou de NHS dans le toluène en dissolvant une petite quantité de NHS dans suffisamment de toluène. Pour les expériences spécifiques, ajoutez de petites quantités de NHS jusqu'à ce que le NHS ne se dissolve plus. La solution saturée est généralement trouble et rose.

Ensuite, préparez l'acrylamide, le BIS acrylamide, l'eau et un PS pour atteindre le pourcentage d'acrylamide souhaité. Ajoutez les réactifs aux tubes de micro-utilisation selon le protocole écrit. Ensuite, un aliquot à la fois.

Ajouter le NHS et le TM me. Vortexer brièvement le tube, puis verser immédiatement entre trois et cinq gels en utilisant 140 microlitres par lame dans les hottes de sécurité biologique. Placer rapidement la lame de 25 millimètres SILICONÉE sur chacun des gels avant qu'il ne commence à polymériser.

L'ajout de la lame couvre-object supérieure permettra à l'acrylamide de recouvrir complètement la lame couvre-object inférieure. Incuber ce sandwich à température ambiante jusqu'à ce que l'acrylamide polymérise afin de déterminer quand la polymérisation s'est produite. Vérifier la solution d'acrylamide résiduelle dans le tube de microcentrifugation.

La polymérisation prendra quelques minutes pour les gels rigides et un peu plus longtemps pour les gels mous. Une fois la polymérisation terminée, soulevez délicatement le sandwich en portant des gants stériles. Ensuite, faites glisser la lame supérieure jusqu'à ce qu'elle dépasse le gel polymérisé.

Ensuite, soulevez le couvercle. Retirez le gel et jetez la lame supérieure. Placez chaque lame inférieure du gel, appelée par la suite hydrogel, dans une plaque de six puits.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS par puits d'une plaque à six puits. Lavez ensuite les hydrogels avec du PBS et incubez-les sur un agitateur rotatif pendant cinq minutes. Répétez ce lavage deux fois.

Pour commencer l'expérience, recouvrez chaque hydrogel de deux millilitres d'une solution de fibronectine ou d'une autre protéine de la matrice extracellulaire. Incubez la protéine sur l'hydrogel toute la nuit à quatre degrés Celsius afin de permettre sa liaison covalente à l'hydrogel ; après une incubation nocturne, aspirez la solution de matrice extracellulaire. Bloquez ensuite les groupes NHS non réagis avec une solution d'albumine sérique bovine sans acide gras, activée par chauffage, à une concentration d'un milligramme par millilitre dans un milieu sans sérum, et incubez pendant au moins 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Après l'incubation, laver les hydrogels une fois avec du PBS stérile. Ensuite, ensemencer les cellules dans le milieu de culture approprié contenant du sérum de veau fœtal sur l'hydrogel ici.

Des fibroblastes embryonnaires de souris établis sont utilisés. Déterminez le nombre de cellules à semer sur l'hydrogel en fonction du degré d'aplatissement et de confluence cellulaire requis pour l'expérimentation. Environ 10 puissance cinq cellules sont nécessaires pour l'analyse par immunobuvardage et par PCR quantitative.

Incubez ensuite les cellules dans des conditions adaptées au type cellulaire spécifique. À l'issue de la période d'incubation, extrayez les protéines cellulaires ou l'ARNm selon les besoins.

Prélèvez à la pipette des gouttes de 100 microlitres de tampon de lyse et déposez-les sur une feuille de paraforme posée sur le plan de travail, en laissant environ deux à trois centimètres entre chaque goutte. Ensuite, retirez délicatement chaque hydrogel en soulevant la lame inférieure du puits. À l’aide de pinces courbes, placez-les côté cellules vers le bas sur le dessus des gouttes.

Incubez les cellules avec le tampon de lyse pendant exactement une minute. Enfin, retirez les lamelles et transférez le tampon de lyse dans un tube de microcentrifugeuse. Alternativement, lors de l'extraction de l'ARN, transférez chaque hydrogel dans une nouvelle plaque à six puits et ajoutez un millilitre de triazole par puits.

Incuber les gels pendant trois minutes après l'incubation. Retirer la solution de triazole pour la conserver dans un tube de microcentrifugeuse. Un lavage soigneux des lamelles après l'ajout d'A-P-T-M-S constitue une étape importante pour produire des lamelles réactives.

Les lamelles correctement lavées et sèches sont exemptes de tout résidu de précipité. L'A-P-T-M-S réagira avec le glutaraldéhyde et produira un précipité blanc et trouble. Si un précipité apparaît, la procédure entière doit être répétée, car la lamelle n'est plus utilisable.

Après la formation de l'hydrogel et son revêtement avec des protéines de la matrice extracellulaire, les cellules sont ensemencées pendant la nuit. On observe une différence marquée entre l'expansion cellulaire sur des hydrogels rigides par rapport à des hydrogels mous, comme le montre le repliement observé en coloration, les fibroblastes embryonnaires de souris s'étalant davantage sur les hydrogels rigides que sur les hydrogels mous. En effet, la majorité des cellules s'attachant à un hydrogel mou restent compactes et s'adhèrent moins efficacement.

Des résultats représentatifs de PCR quantitative des niveaux d'ARNm de la cycline D1 dans des fibroblastes embryonnaires de souris montrent que la cycline D1 est significativement surexprimée sur une matrice rigide, mais pas sur une matrice souple. Cela suggère que la rigidité de la matrice régule la progression du cycle cellulaire in vitro. Nous venons de vous montrer comment générer des hydrogels de rigidité variable, modélisant ainsi les conditions physiologiques in vivo. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de préparer des lamelles réactives supplémentaires, car des accidents et des erreurs peuvent survenir.

Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.