Microscopie intravitale de la microcirculation cérébrale souris en utilisant une fenêtre fermée crânienne

L'objectif général de cette procédure est d'étudier la microcirculation dans le cerveau de la souris par microscopie intravitale, ce qui permet de suivre les changements dynamiques des marqueurs hémodynamiques et inflammatoires dans la microcirculation pileuse sur des périodes prolongées. Cette technique a été développée à l'Institut de bioingénierie de La Jolla, où elle a été utilisée pour de nombreux types d'études. Par exemple, le suivi des modifications hémodynamiques au cours de l'infection par Plasmodium berghei et au moment de l'expression du paludisme cérébral.

Cela est réalisé en implantant d'abord une fenêtre crânienne chronique deux semaines avant les études de microscopie intravitale. La deuxième étape de la procédure consiste à enregistrer la morphologie générale de la fenêtre crânienne à l'aide d'une image numérique haute résolution à faible grossissement. La troisième étape de la procédure consiste à acquérir des images de microscopie intravitale en utilisant un éclairage conventionnel et fluorescent, puis à sélectionner des sites d'étude spécifiques pour effectuer en continu des mesures du diamètre des vaisseaux et de la vitesse des globules rouges.

La dernière étape de la procédure consiste à effectuer une analyse intravitale de l'adhérence des leucocytes et des plaquettes dans les vaisseaux pileux à l'aide d'anticorps spécifiques marqués au fluorochrome. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant in vivo des modifications microcirculatoires dans des modèles cérébraux reflétant des états physiologiques, physiopathologiques ou pathologiques, grâce à la microscopie intravitale cérébrale permettant d'établir les modifications hémodynamiques associées à ces états. Le principal avantage de cette technique est que nous observons le cerveau dans son environnement physiologique sans l'exposer à des agents externes ou à un milieu artificiel. Comparée à l'imagerie par résonance magnétique et à l'angiographie, la microscopie intravitale offre des résolutions spatiale et temporelle élevées et nous permet d'observer des phénomènes allant du niveau macroscopique au niveau microscopique.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en physiologie et en physiopathologie de la microcirculation cérébrale, telles que les modifications hémodynamiques et inflammatoires au cours des maladies aiguës et chroniques. Deux à trois semaines avant la microscopie intravitale, une craniotomie est réalisée chez des souris âgées de huit à dix semaines, comme cela a été décrit précédemment, sauf qu'une barre en titane n'est pas placée sur la tête de l'animal. La fenêtre crânienne chronique constitue une préparation stable, permettant l'examen de la microcirculation pariétale même plusieurs mois après son implantation, le jour de l'expérience.

Tout d'abord, vérifiez la température corporelle de l'animal avant de placer l'animal dans un cadre stéréotaxique ayant reçu préalablement des érythrocytes marqués au fluorochrome injectés par la veine de la queue de la souris. Cela permettra le suivi des érythrocytes, ce qui sera démontré ultérieurement. Ensuite, anesthésiez légèrement la souris à l'isoflurane.

4 % pour l'induction, un à 2 % pour le maintien. Ensuite, placer l'animal en position prona sur un support stéréotaxique posé sur un tapis chauffant. Fixer la tête avec précaution à l'aide des barres auriculaires et régler le niveau à l'aide des leviers droit et gauche.

Nettoyez délicatement la lame couvre-objet de la fenêtre crânienne à l’aide d’un coton-tige humidifié avec de l’huile minérale. Ensuite, à l’aide d’un microscope stéréo relié à une caméra numérique, prenez plusieurs photographies panoramiques des vaisseaux situés sous la fenêtre. Après avoir transféré les photos panoramiques sur un ordinateur, sélectionnez la meilleure image à imprimer, identifier et dater.

Cette photo servira de carte pour les mesures du diamètre des vaisseaux et des vitesses des globules rouges, qui seront démontrées ensuite afin de commencer la microscopie intravitale. Transférez la souris sur un plateau de microscope intravital personnalisé. Déposez une goutte d'eau sur la fenêtre crânienne en profitant du puits formé par l'acrylique dentaire.

Un objectif à immersion dans l'eau de 20 x avec une ouverture numérique de 0,5 est utilisé. Les images sont enregistrées à l'aide de deux caméras : une caméra numérique à faible luminosité et haute vitesse, connectée à un ordinateur et à un moniteur, et une caméra analogique à faible luminosité, connectée à une cassette VCR, à un horodateur et à un moniteur couleur. Avant de sélectionner les vaisseaux à mesurer, vérifiez les vaisseaux afin d'évaluer la qualité de la préparation et de vous assurer que le sang circule dans tous les vaisseaux. Ensuite, sélectionnez les vaisseaux à mesurer. Ceux-ci doivent inclure des veinules et des artérioles de différents diamètres et couvrir différentes localisations au sein de la zone exposée par la fenêtre.

Dans notre expérience, nous sélectionnons 12 vaisseaux pour la mesure, comme vous observez différents champs à l'intérieur de la fenêtre crânienne. Pour sélectionner les vaisseaux, annotez l'emplacement précis de chaque point à mesurer sur la photo de la vascularisation PY qui a été prise précédemment. Pour chaque point, le diamètre du vaisseau est mesuré à l'aide d'un dispositif de cisaillement d'image. Une fois le point sélectionné, l'image du vaisseau est alignée en position verticale et l'image est cisaillée jusqu'aux bords opposés.

Les extrémités sont alignées et la mesure est documentée. Pour le suivi des érythrocytes, chaque point est enregistré par la caméra numérique pendant au moins 30 secondes, et les images vidéo sont capturées à 150 images par seconde. Ce taux est défini de manière à obtenir de une à six images d'une cellule sur une seule image vidéo, afin de déterminer des vitesses allant jusqu'à six millimètres par seconde.

Une fois la collecte de données terminée, retirez la souris du cadre stéréotaxique et remettez-la dans sa cage pour qu'elle se remette de l'anesthésie à l'aide d'un logiciel approprié. Les images vidéo acquises sont numérisées et les données de coordonnées XY pour chaque image de cellule sont obtenues. Les positions des cellules sont déterminées manuellement plutôt que par analyse d'image.

Étant donné que l'œil d'un observateur expérimenté permet d'estimer correctement la position du centre d'une cellule, qui correspond en général à l'emplacement de la fluorescence maximale observée. Pour la plupart des orientations cellulaires, les déterminations de position et de vitesse sont effectuées sur 15 cellules dans chaque vaisseau. Une moyenne est ensuite calculée pour obtenir la vitesse moyenne des hématies une fois que les mesures du diamètre du vaisseau et de la vitesse des hématies sont disponibles.

Le calcul du débit sanguin dans chaque vaisseau peut être effectué à l'aide de la formule Q égale D sur deux au carré fois PI fois V, où Q correspond au débit sanguin, V à la vitesse des globules rouges et D au diamètre du vaisseau, afin d'évaluer la perfusion et d'analyser l'adhérence des leucocytes dans les vaisseaux pile. La microscopie intravitale est réalisée sur un animal perfusé avec un mélange d'albumine marquée au FSE et d'anticorps dirigés contre le marqueur pan-leucocytaire CD45 marqué au Texas Red. L'albumine marquée de manière fluorescente permet une meilleure visualisation du réseau vasculaire, y compris des vaisseaux pénétrants, et s'avère particulièrement utile dans les états pathologiques tels que le paludisme cérébral pour détecter les vaisseaux non perfusés ou sous-perfusés.

Les anticorps anti-CD45 marqués au fluorochrome permettent d'identifier facilement les leucocytes roulant et leur adhésion aux vaisseaux pileux. La quantification de l'adhésion des leucocytes est réalisée en comptant le nombre de leucocytes sur une longueur de vaisseau de 100 microns. Le roulement est quantifié en comptant le nombre de leucocytes circulant à une vitesse nettement inférieure à la vitesse sanguine, sur la même longueur de 100 microns, pendant 30 secondes. Illustré.

Voici un exemple de mesures de la vitesse des globules rouges dans la microcirculation, obtenues par le suivi cellulaire à partir de vidéos fluorescents à haute vitesse. Les enregistrements vidéo des images A à F sont des séquences de la microcirculation. Chaque image représente la position d'un seul globule rouge en écoulement, capturée image par image par la caméra à haute vitesse.

Ce graphique provenant d'une expérience représentative montre les variations du flux sanguin pileux au fil du temps chez des souris infectées par Plasmodium bergi onca et chez des souris témoins non infectées, alors que chez les souris témoins, le flux sanguin pileux reste relativement stable au cours du temps. Les souris infectées par PBA présentent une diminution marquée du flux sanguin au moment du développement du paludisme cérébral.

À J6, une coloration par des anticorps fluorescents anti-CD45 marqués au Texas Red révèle un grand nombre de leucocytes adhérant aux vaisseaux sanguins d'une souris infectée par Plasmodium berghei. Cette procédure possède un large éventail d'applications en dehors de celle présentée ici aujourd'hui. Toute technique optique pouvant être utilisée in vivo peut être adaptée à ce modèle, et des paramètres tels que le tissu, le taux d'oxygène tissulaire, le pH, les espèces réactives de l'oxygène et les interactions endothéliales avec les leucocytes peuvent être étudiés dans ce modèle.