Une méthode pour le 2-Photon Imaging du flux sanguin dans le néocortex travers une fenêtre crânienne

La capacité d'imaginer la vascularisation cérébrale et d'enregistrer la dynamique du flux sanguin dans le cerveau intact de rongeurs vivants constitue une technique puissante applicable à l'étude de l'ischémie cérébrale ou de la physiologie cérébrale normale. Nous allons ici démontrer comment utiliser deux microscopes photoniques pour visualiser la dynamique du flux sanguin dans le néocortex de souris vivantes à l'aide de colorants fluorescents injectés dans la veine de la queue. Cette technique a été initialement développée par David Kleinfeld à Winfred Dank.

Bonjour, je suis Ricardo Mota du laboratoire de Carlos Porter Cayo, du département de neurologie de l'Université de Californie à Los Angeles. Dans une vidéo précédente, nous vous avons montré la méthode d'implantation d'une fenêtre crânienne pour des expériences d'imagerie chronique in vivo. Aujourd'hui, nous allons vous présenter la procédure d'imagerie des dynamiques de flux sanguin dans le cortex cérébral à travers une fenêtre crânienne.

Cette préparation est très utile car elle permet d'obtenir des images en profondeur dans le cerveau à l'aide de la microscopie laser à deux photons. Commençons donc. Afin d'imaginer la vascularisation cérébrale, les animaux doivent être injectés par voie intraveineuse avec un colorant fluorescent.

Nous utilisons des colorants conjugués à la dextrane parce que le motif dextrane empêche le colorant de traverser la barrière hémato-encéphalique et de s'échapper des vaisseaux sanguins. Les souris sont anesthésiées à l'isoflurane, à 4 % pour l'induction et de 1,5 à 2 % pendant l'injection. Ensuite, la queue est désinfectée avec trois tampons d'alcool à 70 %. À l'aide d'une aiguille de calibre 26, 75 à cent microlitres d'une solution à 5 % de dextrane de rhodamine dissoute dans du sérum physiologique sont injectés par voie intraveineuse dans la queue.

À mi-longueur du manche de la queue, les animaux peuvent être imagés immédiatement après l'injection intraveineuse dans la queue jusqu'à l'élimination du colorant par l'urine, qui devient rose si l'on utilise le colorant ERO domine. Environ deux heures après l'injection du colorant fluorescent Dexter, la souris est anesthésiée à l'isoflurane : à nouveau, 4 % pour l'induction, 1 à 1,5 % pour l'imagerie. La souris est solidement fixée à l'aide d'une barre en titane sur la platine du microscope, équipée d'un tapis chauffant régulé thermiquement afin de maintenir l'animal au chaud.

Une pommade oculaire est appliquée pour maintenir les yeux humides. La lame de verre de la fenêtre crânienne est nettoyée avec de l'alcool à 70 %. La fenêtre est positionnée parallèlement au plan focal et centrée dans le champ de vision.

Avec l'objectif 4 x, il est préférable de prendre une photographie des vaisseaux de la surface du cerveau à l'aide d'un appareil photo numérique. Cette image servira de référence lors des séances d'imagerie ultérieures afin de retrouver régulièrement la région d'intérêt jour après jour. L'objectif 4 x est ensuite remplacé par un objectif à immersion dans l'eau de 40 x.

Sans déplacer la platine, l'image numérique du champ est capturée. À nouveau, les coordonnées du manipulateur de platine sont réglées à zéro. Nous utilisons Scan Image comme logiciel d'acquisition d'images.

Ceci a été écrit en MATLAB par Tom Paul Rudo et Bernardo Sabatini dans le laboratoire de Carls Voto. Nous allumons ensuite tous les autres équipements : le laser, le puissancemètre, les tubes photomultiplicateurs, les amplificateurs, etc. La zone de la fenêtre appropriée pour l'imagerie est brièvement balayée à faible grossissement afin d'identifier les meilleures régions.

Une fois ces éléments identifiés, on acquiert la pile en faible grossissement de la région choisie à imager et ses coordonnées XY sont annotées afin d'enregistrer la dynamique du flux sanguin dans de petits vaisseaux ou des capillaires. Nous utilisons des balayages en ligne sur une longueur d'au moins 40 micromètres du vaisseau d'intérêt. Ces balayages uniques, d'une durée d'une seconde, sont réalisés avec la puissance laser la plus faible possible, et les coordonnées ainsi que l'angle de balayage sont notés.

Une fois la séance d'imagerie terminée, l'animal est transféré dans une chambre chauffée où il peut se remettre de l'anesthésie. Nous montrons ici une pile de cent images prises toutes les cinq microns à l'aide de notre microscope à deux photons, à travers une fenêtre crânienne placée au-dessus du cortex somatosensoriel d'une souris âgée de cinq mois, à laquelle on a injecté du dextran r Domine par la veine caudale. Cette séquence d'images révèle le réseau complexe de vaisseaux sanguins de grande et petite taille, incluant les capillaires.

Nous venons de vous présenter une méthode permettant la visualisation des dynamiques de flux sanguin in vivo à travers une fenêtre crânienne. Il s'agit d'une méthode extrêmement puissante pour l'imagerie des dynamiques du flux sanguin cérébral dans la vascularisation corticale, par exemple afin d'étudier les modifications du flux sanguin après un accident vasculaire cérébral. De multiples acquisitions d'images peuvent être réalisées à différents moments chez les souris en effectuant des injections répétées dans la veine caudale du colorant fluorescent.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler dans des conditions aussi propres et stériles que possible et de disposer d'une main très ferme. Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.