Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer l'activation des canaux BK sous tension contrôlée, tout en maîtrisant la solution intracellulaire. Cela est réalisé en exprimant d'abord les canaux BK dans des cytes de Xenopus en les injectant avec un ARNm codant pour les canaux BK. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer le système de perfusion.

La troisième étape de la procédure consiste à former un scellement gigaseal entre la membrane de l'ovocyte et la micropipette de patch. La dernière étape de la procédure est d'exciser le fragment membranaire. En définitive, les résultats obtenus à l'aide de la technique de patch clamp couplée à un système de perfusion montrent que les canaux BK sont activés par des variations du potentiel électrique et de la concentration en calcium.

Bonjour, je suis Jin Cho Young du laboratoire du Dr. Jamie Zu à l'Université de Washington. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine des neurosciences, notamment des questions relatives aux mécanismes moléculaires d'activation des canaux ioniques. Commençons donc.

La première étape de la procédure commence quelques jours avant le patch-clamp et utilise un ARN messager des canaux BK transcrit in vitro. Après avoir récolté les ovocytes de Xenopus laevis au stade cinq à six, injectez de 0,05 à 50 nanogrammes d'ARN messager des canaux BK dans un ovocyte. Utilisez un nanoinjecteur automatique de deux nanolitres.

Répétez l'injection sur une douzaine d'ovocytes pour chaque ARNm après l'injection. Rincez les ovocytes deux fois à l'aide de la solution ND 96. Ensuite, placez les ovocytes dans une plaque de culture et incubez-les à 18 degrés Celsius pendant deux jours ou plus afin de permettre aux ovocytes d'exprimer le canal BK.

Après deux à cinq jours d'incubation, les ovocytes devraient exprimer des canaux BK et sont donc déjà prêts pour la technique de patch clamp. Avant de manipuler les ovocytes, préparez tout le matériel nécessaire pour le patch clamp, en commençant par le système de perfusion. Le système illustré ici est le lien de valve automatisé.

Le système de profusion 16 utilise de l'azote sous pression pour pousser les solutions de profusion hors des réservoirs de solution, à travers les tubulures de profusion, puis vers le stylet et son embout. Le flux de chaque courant de solution de profusion est contrôlé par une vanne de réservoir et une vanne électronique. Dans ce protocole, l'un des réservoirs n'est pas pressurisé et sert de collecteur de déchets, ainsi que de mécanisme de décharge de pression.

Des solutions de perfusion à différentes concentrations de calcium ou de magnésium peuvent être préparées avant les expériences. Ajoutez les solutions de perfusion aux réservoirs et étiquetez chacun pour indiquer la concentration de calcium ou de magnésium. Pour installer le système de perfusion, commencez par raccorder les tubulures au stylet de perfusion.

Ensuite, allumez le contrôleur de valve électronique et ouvrez les vannes électroniques pour vous assurer que les tubulures et le crayon de perfusion sont exempts de bouchons et de bulles d'air. Faites passer de l'eau déionisée dans chaque tubulure à l'aide d'une seringue remplie d'eau déionisée. À ce stade, reliez les tubulures aux réservoirs de solution et ouvrez la vanne du cylindre de gaz pour appliquer une pression d'azote.

Ouvrez une vanne de réservoir pour remplir le tube avec l'une des solutions de réservoir. Si nécessaire, cliquez sur la vanne de réservoir pour éliminer les bulles dans la solution. Fermez la vanne de réservoir une fois le tube rempli de solution, remplissez la pointe de perfusion avec de l'eau et vissez-la sur le crayon de perfusion.

Veillez à ne pas emprisonner de bulles. Lors de la connexion de l'embout, fixez le stylet de perfusion sur le plateau du bain à l'aide d'argile à modeler, et assurez-vous que l'embout de perfusion se trouve dans l'espace du bain. Le système de perfusion est désormais prêt.

À ce stade, ajoutez de l'eau déionisée dans le bain. Assurez-vous que l'extrémité de perfusion est immergée dans l'eau. Vérifiez que chaque solution de perfusion s'écoule correctement par l'extrémité de perfusion.

Fermez la vanne électronique reliée au tube du collecteur de déchets et ouvrez la vanne correspondant à l'une des solutions de perfusion. Sous le microscope, observez le jet de liquide de perfusion sortant de l'embout de perfusion. Fermez la vanne de cette solution de perfusion et ouvrez la vanne du collecteur de déchets.

Le jet de perfusion devrait presque disparaître. Répétez le même test pour chacune des solutions de perfusion. Une fois que vous avez vérifié que toutes les solutions de perfusion s'écoulent correctement, remplacez l'eau déionisée dans le bain par la solution de bain souhaitée.

Il est maintenant temps de mettre en place l'appareil d'enregistrement. Vous devez recharger l'électrode d'enregistrement en argent avec du chlorure d'argent avant chaque séance de patch-clamp. Tout d'abord, retirez le fil de l'électrode du porte-pipette et immergez la moitié de la pointe du fil de l'électrode dans un flacon contenant de l'eau de Javel fraîche pendant au moins 15 minutes.

Cela dépose une couche de chlorure d'argent sur le fil. Rincez le fil de l'électrode avec de l'eau déionisée et séchez-le en tamponnant. Ensuite, réinstallez l'électrode en argent-chlorure d'argent dans le porte-pipette.

Allumez maintenant votre ordinateur. Branchez la clé matérielle sur le port imprimante de votre ordinateur. La clé matérielle doit être branchée pour que vous puissiez utiliser le logiciel d'acquisition de données, qui est HEA pulse.

Activez l'amplificateur et lancez le logiciel d'acquisition de données. Impulsion HEA. Chargez le fichier de protocole et ajustez les paramètres de configuration, tels que l'échelle du stimulus.

L'objectif de l'ajustement des paramètres de configuration est de s'assurer que le potentiel de test est exactement égal au potentiel de commande. Nous sommes maintenant prêts à préparer les ovocytes. Récupérez les ovocytes à partir de l'incubateur.

Immergez l'ovocyte dans la solution de décapage pendant cinq à dix minutes. La solution de décapage détache la membrane vitelline de la membrane plasmique, ce qui permet d'enlever la membrane vitelline. Après cinq à dix minutes, retirez délicatement la membrane vitelline de l'ovocyte.

À l’aide de deux pincettes. Un site divi OC est extrêmement fragile et doit donc être déplacé le moins possible. En prenant soin d’éviter toute exposition de l’ovocyte Devi à l’air ou aux bulles, utilisez une pipette en verre remplie d’une quantité suffisante de solution pour transférer l’ovocyte dans le bain.

Les canaux présents sur la membrane de l'ovocyte sont désormais exposés et prêts pour la micropipette de patch. Fabriquez une micropipette de patch en insérant un tube capillaire en verre dans le tireur de micropipettes. Observez les micropipettes au microscope afin de déterminer la forme de la pointe et le diamètre de l'ouverture.

Le diamètre d'ouverture doit être compris entre deux et quatre micromètres afin de réduire le courant capacitif pendant l'enregistrement, et pour assurer une pointe lisse, enduire la pointe de cire puis la chauffer. Polir sous un microscope. Remplir la pointe de pipette en plaçant celle-ci dans la solution de pipette et en tirant sur le piston.

Cela humidifie la pointe de la pipette. Ensuite, remplissez la pipette au tiers avec la solution de pipette à l’aide d’une seringue. Puis placez la pipette dans le porte-pipette, avec l’électrode en argent recouverte de chlorure d’argent à l’intérieur.

Veillez à ce que l'électrode métallique soit en contact avec la solution de la pipette. L'étape suivante consiste à exciser une membrane en configuration « à l'envers » à partir de l'ovocyte préparé. Tout d'abord, repérez le bord net de l'ovocyte au microscope.

À l’aide du manipulateur, déplacer la pipette de patch près de l’oocyte en veillant à ce qu’elle soit immergée. Dans la solution de bain, enregistrer la résistance série de la pipette. La résistance série idéale de la pipette de patch est comprise entre un et 1,5 milliohms lorsqu’elle est remplie de solution de pipette et immergée dans la solution de bain.

Appuyez maintenant lentement la pipette contre l'ovocyte jusqu'à ce que sa résistance double environ. Obtenez un scellement gigaohm en appliquant une aspiration douce par la bouche à l'aide d'un tube d'aspiration relié au porte-pipette. Après avoir confirmé la formation d'un scellement gigaohm, stabilisez le patch en le maintenant à moins 30 millivolts pendant quelques minutes.

Pour obtenir un patch en configuration « intérieur vers l'extérieur », excisez le patch en poussant rapidement la pipette plus profondément dans le site OO, puis en la retirant délicatement. Le patch en configuration « intérieur vers l'extérieur » est désormais prêt pour la technique du patch clamp. Déplacez la pipette contenant ce patch à environ 100 micromètres de l'ouverture de l'embout de perfusion.

Fermez la vanne électronique de collecte des déchets et ouvrez la vanne du réservoir contenant la solution de perfusion souhaitée. Commencez l'enregistrement des courants traversant le patch. Modifiez la tension et les solutions de perfusion selon les besoins.

Lorsque vous avez terminé l'enregistrement, nettoyez le stylet et la pointe des tubulures de perfusion en faisant passer de l'eau déionisée afin d'éviter les obstructions. Les enregistrements en électrode à patch obtenus ici montrent que les canaux BK de type sauvage dans un fragment de membrane d'ovocyte répondent à la fois à la tension et au calcium. Cette figure présente un enregistrement en mode patch avec une concentration nominale de calcium nulle dans la solution de perfusion.

Les ondes carrées au-dessus des tracés de courant indiquent la tension appliquée au patch. Quatre tensions ont été appliquées, allant de 50 millivolts à 200 millivolts par incréments de 50 millivolts. Le courant maximal, d'environ deux nanoampères, a été obtenu avec la tension maximale de 200 millivolts.

Cet accroissement de l'amplitude du courant avec une augmentation de la tension indiquait que la probabilité d'ouverture des canaux BK augmentait avec la tension. Cette figure montre la réponse du patch en configuration « cytoplasme sortant » à différentes tensions. Lorsqu'une concentration d'un micromolaire de calcium était présente dans la solution de perfusion, des paliers de tension ont été appliqués.

Comme dans la figure précédente, la réponse à l'impulsion de tension de 200 millivolts, la réponse supérieure a augmenté jusqu'à environ trois nanoampères en présence de calcium dans le Perfu huit, par rapport à deux nanoampères en l'absence de calcium. Cela indique que la probabilité d'ouverture des canaux BK augmente en présence de calcium. En résumé, cette procédure de patch-clamp a montré que les canaux BK dépendent à la fois de la tension et du calcium.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment enregistrer l'activation du canal ferrique à l'aide de la technique de patch clamp couplée à un système de perfusion de solutions. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.