Combinaison de adhésif à base de bandes d'échantillonnage et de fluorescence In situ pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

L'objectif général de cette procédure est d'associer un prélèvement sur produits frais à l'aide de ruban adhésif à une détection moléculaire en cellules entières d'espèces de salmonelles par hybridation rapide par fluorescence en deux composants, également connue sous le nom de fish. Cette approche est réalisée en appliquant d'abord un ruban adhésif sur le matériau souhaité afin d'extraire les cellules liées à la surface. Les rubans contenant les cellules peuvent être analysés directement ou soumis à des enrichissements en phase solide ou liquide.

La deuxième étape de la procédure consiste à fixer sur bande, par auto-fixation, et à déshydrater dans une série d'éthanol les cellules mentionnées ou enrichies dans un bouillon. La deuxième étape implique la fixation des cellules en suspension, suivie de la resuspension des cellules dans un tampon de conservation. La troisième étape de la procédure consiste à effectuer une hybridation rapide sur bande à l'aide d'un mélange de sondes oligonucléotidiques spécifiques de Salmonella, puis à éliminer l'excès de sonde par un rinçage avec un tampon de lavage ; pour les échantillons analysés par fax, l'étape FISH est réalisée en suspension, et l'excès de sonde peut être éliminé par une simple dilution avant l'analyse.

La dernière étape de la procédure consiste à contre-colorer les cellules fixées sur le ruban hybridé avec du DPI et à les examiner par microscopie en fluorescence. Pour les analyses fondées sur des faits, un contre-colorage n'est pas nécessaire. En fin de compte, cette méthode permet une détection visuelle ou cytométrique d'espèces de salmonelles pouvant être présentes sur les produits frais échantillonnés.

J'ai eu pour la première fois l'idée de cette méthode en lisant un article sur un groupe italien qui utilisait une approche similaire pour examiner les communautés bactériennes présentes sur des vestiges romains en pierre aéro. Mais r et moi avons dirigé une discussion sur ce travail dans un cours que j'enseignais sur les méthodes rapides en microbiologie alimentaire. Quelques semaines plus tard, une éclosion de salmonelle liée à des produits frais a commencé, rendant finalement près de 1500 personnes malades dans 43 États différents.

Bien que notre approche expérimentale offre une méthode opportune et pratique pour la détection de types bactériens spécifiques sur les produits frais, elle est également suffisamment portable pour permettre des tests sur le terrain ou dans un environnement de production alimentaire. Commencez par sélectionner un ruban adhésif à utiliser pour l'échantillonnage. Certaines options incluent le ruban adhésif pour champignons disponible dans le commerce ou les contacts stériles, qui sont également conditionnés pour faciliter leur utilisation.

Avec un marqueur indélébile, dessinez des carrés d'un centimètre de côté sur le côté non collant d'une bande adhésive de 10 centimètres à l'aide d'un gabarit en aluminium stérile. Ceci servira de guide visuel pour indiquer quelle portion de la bande a été utilisée pour prélever un échantillon de la surface alimentaire ou environnementale en formant une boucle en forme de C avec la bande, le côté collant tourné vers la surface à échantillonner. Pour ce faire, tenez les extrémités collantes entre le pouce et le majeur, et placez l'index contre le carré dessiné au dos de la bande.

Placez le ruban adhésif sur la surface à échantillonner et appuyez doucement la zone marquée contre la surface sans relâcher les bords du ruban. Utilisez l'index pour vous assurer que la face collante du ruban entre pleinement en contact avec la surface de l'échantillon. Évitez les bulles en effectuant un mouvement uniforme.

Tirez lentement le ruban adhésif loin de l'échantillon. L'extraction physique des micro-organismes liés à la surface fixe la charge cellulaire. Placez le ruban, côté collant vers le haut, sur une lame de microscope en verre. En utilisant un ruban adhésif transparent ordinaire, assurez-vous d'appliquer une tension et une extension adéquates du ruban afin de créer une surface plane sans plis.

Cela permettra de minimiser les problèmes de déformation ou de recourbement du ruban pendant le chauffage ultérieur. Pendant l'hybridation, placez le ruban face vers le bas sur des plaques XLT4 (xylose slicing tertile four) afin que les cellules prélevées soient en contact direct avec la surface agri, ce qui facilite le retrait du ruban de la surface agri.

Après l'enrichissement, la partie du ruban contenant l'échantillon mis en culture est placée à fleur de la surface de l'agar, et une extrémité du ruban est légèrement fixée. Les boîtes de Petri sont retournées pour éviter la condensation et incubées à 35 degrés Celsius. Afin de permettre une croissance suffisante des espèces de salmonelles, la durée d'incubation nécessaire pour enrichir les cellules à un niveau détectable dépendra du niveau initial de contamination par la salmonelle.

Après la période d'enrichissement souhaitée, ouvrez la boîte de Pétri ; le ruban conservera son adhérence durant l'incubation. Appuyez délicatement le ruban contre l'agar à l'aide de l'index afin d'assurer une récupération maximale des microcolonies formées à l'interface entre le ruban et l'agar. Saisissez le ruban par le bord fixé à la paroi de la boîte de Pétri et retirez-le d'un mouvement lent et régulier. À l'aide d'un ruban adhésif transparent ordinaire, fixez le ruban portant les cellules, côté collant vers le haut, sur une lame de microscope, de manière à obtenir une surface plane et sans plis.

Réaliser une fixation cellulaire sur ruban pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius en recouvrant la zone de contact de l'échantillon avec 500 microlitres de formol tamponné neutre à 10 %. Jeter le fixateur dans un récipient hermétique sous une hotte chimique afin de minimiser l'exposition aux vapeurs irritantes ou toxiques, puis rincer le ruban une fois dans du tampon salin phosphate 1 x ou PBS en inondant doucement la surface du ruban avec du PBS pour déshydrater l'échantillon. À l'aide d'une série progressive d'éthanol, préparer les tampons de pré-hybridation, d'hybridation et de lavage à partir de solutions commerciales de qualité biologie moléculaire, filtrer à l’aide d’une seringue de 0,22 micromètre et préchauffer les tampons d'hybridation et de lavage à 55 degrés Celsius.

Ajouter des sondes d'oligonucléotides marquées par fluorescence au tampon d'hybridation préchauffé pour obtenir une concentration finale de sonde de cinq nanogrammes par microlitre. Recouvrir la zone de contact de l'échantillon matricé sur le ruban avec 300 microlitres de tampon d'hybridation contenant le mélange de sondes, puis hybridiser les cellules fixées sur le ruban dans une chambre d'incubation humide et hermétique réglée à 55 degrés Celsius ; pour un incubateur à contact direct, tel que l'instrument en mode lame, effectuer l'hybridation pendant 15 minutes. Après l'hybridation, retirer les lames et éliminer la couche de tampon d'hybridation contenant la sonde. Rincer brièvement et délicatement avec le tampon de lavage préchauffé à l'aide d'une pipette.

Un petit volume de tampon déposé sur une lame inclinée permet de faire sécher les lames à l'air pour la détection de *Salmonella* spp. par microscopie à fluorescence. Recouvrir la lame d'environ 10 microlitres de Vector Shield H 1200, milieu de montage contenant du DAPI, colorant nucléaire de contre-coloration, puis incuber à l'obscurité pendant 10 minutes. Déposer de l'huile à immersion sur la lamelle et examiner les échantillons à l'aide d'un objectif à immersion à fort grossissement.

Le filtre DPI sert à mettre l'échantillon au point. Le microscope est ensuite basculé sur le filtre approprié, et les cellules de salmonelle sont comptées visuellement selon leur fluorescence verte ou rouge, en fonction du colorant utilisé pour marquer les sondes. Pour la détection par cytométrie en flux, transférer les échantillons en suspension dans du PBS vers des tubes de prélèvement ronds de cinq millilitres et examiner à l'aide d'un cytomètre en flux avec une excitation à 647 nanomètres.

Analyser les données à l'aide du logiciel FlowJo. L'échantillonnage par ruban adhésif de la sérovar de *Terica*, *Ty Murium*, à partir de la surface d'une tomate artificiellement contaminée permet une analyse directe post-fish par microscopie ou cytométrie en flux de la charge cellulaire. Les rubans ont été traités pour une hybridation rapide en fluorescence in situ en deux couleurs en utilisant une combinaison de sondes d'ADN spécifiques de *Salmonella* marquées au Texas Red, selon la concentration locale initiale de cellules de *Salmonella* sur le ruban.

L'enrichissement en phase solide a donné des résultats allant de microcolonies isolées à une croissance confluente. Les cellules prélevées par méthode adhésive peuvent être analysées par cytométrie en flux combinée à la technique FISH, soit immédiatement après le prélèvement, soit après un enrichissement en culture liquide de cinq heures à la surface, à 35 degrés Celsius.

Bien que nous ayons décrit l'utilisation de la technique du poisson-adhésif pour la sécurité alimentaire, cette méthode présente également un bon potentiel d'application dans d'autres disciplines, telles que la microbiologie environnementale, la pathologie végétale ou la microbiologie clinique. Parallèlement à cette procédure, des expériences supplémentaires telles que des tests biochimiques ou des analyses par PCR peuvent être réalisées à partir d'enrichissements en phase solide ou liquide provenant d'échantillons extraits par la méthode adhésive. Ces tests permettent de répondre à des questions concernant une éventuelle présence de salmonelle, des questions qui dépassent le cadre de la procédure du poisson-adhésif.