Bacterial Detection & identification au moyen de capteurs électrochimiques

L'objectif général de l'expérience suivante est de détecter et d'identifier des bactéries à l'aide de capteurs électrochimiques. Cela est réalisé en libérant d'abord l'ARN ribosomique des bactéries afin de permettre l'hybridation avec la sonde détectrice fluorée, puis, dans une deuxième étape, l'ARN ribosomique lié à la sonde détectrice est ajouté à l'électrode de travail, ce qui permet l'hybridation avec la sonde de capture à la surface du capteur. Ensuite, on laisse le conjugué anti-fluorescéine peroxydase de raifort se lier à la sonde détectrice fluorée.

Enfin, dans le courant interférométrique, l'intensité, qui est corrélée au nombre de complexes formés par la sonde de capture ribosomale et la sonde détectrice d'ARN sur la surface du capteur, peut être obtenue. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes basées sur la culture est que les bactéries peuvent être détectées et identifiées en environ 45 minutes, évitant ainsi l'attente d'une nuit nécessaire à la formation de colonies visibles sur une boîte de culture EDGAR. L'application de cette technique améliorerait la prise en charge des maladies infectieuses.

La détection précoce des agents pathogènes bactériens étant essentielle pour une antibiothérapie ciblée et une amélioration des résultats cliniques. Bien que cette méthode soit utile pour le diagnostic des maladies infectieuses, elle peut également être appliquée à d'autres problèmes diagnostiques, tels que l'immunodiagnostic. Commencez par incuber la sonde de capture diluée avec l'hexane di-thiol pendant 10 minutes à température ambiante afin de garantir la réduction du groupe thiol sur la sonde de capture, ce qui donne des résultats plus reproductibles.

Après l'incubation, appliquez un courant d'azote sur la puce du capteur en or 16 pendant cinq secondes pour éliminer toute humidité ou particules. De petits volumes de liquide doivent être appliqués soigneusement sur l'électrode de travail de la matrice de capteurs. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle.

Étant donné qu'une exécution correcte des techniques de pipetage, de lavage et de séchage réduit considérablement la variabilité entre les puces, appliquez ensuite six microlitres du mélange dilué de sondes de capture HDT sur l'électrode de travail des 16 capteurs du réseau de capteurs, puis conservez les puces de capteurs dans une boîte de Pétri fermée à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, lavez les puces de capteurs avec de l'eau déionisée pendant deux à trois secondes, puis séchez-les sous un flux d'azote pendant cinq secondes. Appliquez maintenant six microlitres de la solution d'atride d'hydrochlorure de sodium, EDTA et mercaptoéthanol sur l'électrode de travail des 16 capteurs, puis incubez les capteurs pendant 50 minutes dans une boîte de Pétri à température ambiante.

Pour préparer les échantillons destinés au test du capteur électrochimique, transférez un millilitre de culture bactérienne en phase de croissance logarithmique dans un tube de microcentrifugeuse, puis centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 16 000 ×g. Veuillez noter que les bactéries pathogènes doivent être manipulées dans une hotte de biosécurité.

Après avoir retiré le snat, appliquez une pointe de pipette contenant 10 microlitres d'hydroxyde de sodium un molaire au fond du tube de microcentrifugation et pipetez plusieurs fois de haut en bas pour resuspendre complètement le culot. Après avoir incubé la suspension à température ambiante pendant cinq minutes, ajoutez 50 microlitres de PBS contenant de l'albumine de sérum bovin ou BSA et une sonde de détection marquée par la fluorescéine afin de neutraliser le lysat bactérien. Incubez ensuite le lysat neutralisé pendant 10 minutes à température ambiante.

Commencez cette étape en rinçant la solution de mercaptoéthanol d'une des puces de capteur préparées avec de l'eau déionisée pendant deux à trois secondes. Après avoir séché la puce comme vient de l'être démontré, appliquez quatre microlitres du lysat bactérien neutralisé sur les électrodes de travail. 14 des capteurs.

Appliquez ensuite quatre microlitres de l'oligonucléotide de liaison dans le PBS contenant de l'albumine de sérum bovin (BSA) et la sonde détectrice marquée par la fluorescéine sur les deux capteurs de contrôle positif. Après une incubation des lysats et des capteurs de contrôle positif pendant 15 minutes, lavez puis séchez l'ensemble de la puce à capteurs comme précédemment. Appliquez maintenant quatre microlitres d'anticorps anti-fluorescéine liés à la peroxydase de raifort (HRP) dans du PBS contenant de la caséine sur les électrodes de travail des 16 capteurs.

Après une incubation de 15 minutes, lavez et séchez la puce capteur. Ensuite, appliquez un autocollant de puits sur la surface de la puce capteur et chargez la puce dans le support de puce capteur. Ajoutez 50 microlitres de substrat TMB sur l'ensemble des 16 capteurs, puis fermez le support de puce capteur. Enfin, utilisez un lecteur de puce Helios pour obtenir des mesures de pyrométrie et de télémétrie cyclique pour les 16 capteurs.

Le test électrochimique que l'on vient de décrire est structuré de manière similaire à un test ELISA sandwich : comme illustré sur cette figure, l'hybridation de l'ARN ribosomique cible avec les sondes de capture et de détection est révélée par une réaction d'oxydoréduction catalysée par la peroxydase (HRP) conjuguée à des fragments d'anticorps anti-fluorescéine qui se lient au groupement fluorescéine triphénylique présent sur la sonde de détection. Un composant essentiel de la sensibilité du test est la chimie de surface de l'électrode en or. L'électrode en or est recouverte de mercaptoéthanol et d'hexanol, puis fonctionnalisée par l'ajout de sondes de capture diluées.

L'hybridation sandwich de l'ARN ribosomique cible avec la sonde de capture et la sonde de détection marquée par la fluorescéine donne lieu à un complexe détecté par l'ajout du conjugué de peroxydase de raifort anti-fluorescéine et du substrat TMB. Le courant paramétrique M est généré par le cycle redox résultant de l'oxydation du TMB par la peroxydase de raifort et de la réduction du TMB par les électrons provenant de l'électrode. Les dosages décrits ici utilisent une puce à matrice de capteurs 16 voies de type gene fluidic.

Chacun des capteurs de la matrice contient trois électrodes — une électrode de travail, une électrode de référence et une électrode auxiliaire — qui possèdent des points de contact situés au bord de la puce. Le lecteur de puce est équipé de broches élastiques qui se connectent à chacun de ces points de contact. Le lecteur de puce sert d'interface entre la matrice de capteurs et un potentiostat contrôlé par un algorithme informatique.

Ici, des exemples de flux de courant dans un capteur électrochimique sont présentés. Le flux de courant dans les capteurs est artificiellement élevé pendant les premières secondes suivant le début des mesures paramétriques. En raison de l'accumulation de substrat oxydé pendant la période allant de l'application du TMB sur la surface du capteur au lancement de l'algorithme du lecteur, le flux de courant atteint ensuite rapidement un état stable, et des mesures fiables du capteur peuvent être obtenues de manière constante en 60 secondes.

La variabilité d'un capteur à l'autre est relativement constante, ce qui permet d'effectuer en parallèle 16 dosages différents sur la puce à matrice de 16 capteurs à fluidique génique. Des contrôles positifs et négatifs sont essentiels ; à titre de contrôle positif, on utilise un oligonucléotide d'ADN de liaison synthétique qui s'hybride aux sondes de capture et de détection, servant ainsi de cible synthétique de concentration connue. Les résultats obtenus à l'aide de l'oligonucléotide de liaison servent de contrôle interne d'étalonnage afin de minimiser les variations entre les puces.

Plus le courant négatif de l'électrode est élevé, plus le signal est important. Lors des tests avec les sondes de capture et de détection. La limite de détection doit être déterminée par dilution en série d'un échantillon de concentration connue, comme illustré sur cette figure, où il existe une corrélation logarithmique linéaire entre la concentration de l'échantillon et le signal en sortie sur la plage dynamique du test.

Sur ces histogrammes, les résultats représentatifs pour des échantillons contenant Escherichia coli, Klebsiella et de l'ammoniac, fréquemment présents dans l'urine de patients atteints d'infection des voies urinaires, sont présentés. Les signaux pour la plupart des capteurs seront faibles et similaires, et ces résultats négatifs peuvent être regroupés comme signal de fond. La paire de sondes KE permet de distinguer Klebsiella d’Escherichia coli. L'oligonucléotide de liaison sert de contrôle positif et d'étalon interne de calibration. Cette technique peut être appliquée à la détection de bactéries résistantes aux antibiotiques dans des prélèvements cliniques en mesurant la réponse phénotypique des bactéries aux antibiotiques.

Cette technique peut être utilisée pour déterminer le traitement optimal pour un patient donné. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment détecter et identifier des bactéries en comparant les courants atriques dans les différents capteurs spécifiques aux espèces présents sur la puce.