Potentiels de membrane, les réponses synaptiques, circuits neuronaux, neuromodulation et histologie muscle en utilisant l'écrevisse: des exercices de laboratoire étudiant

Les objectifs généraux des expériences suivantes sont de comprendre les propriétés des membranes excitables et la base ionique du potentiel de membrane au repos, ainsi que d'apprendre des méthodes permettant de mesurer le potentiel de membrane et de démontrer les propriétés de la transmission synaptique. Dans une partie de l'expérience, le potentiel de membrane au repos sera mesuré tout en modifiant la concentration de potassium extracellulaire. Dans une autre partie de l'expérience, les mécanismes de la différenciation synaptique seront étudiés en enregistrant des réponses synaptiques stimulées dans diverses unités motrices.

Ensuite, un circuit neuronal facile à maintenir est présenté. Ce montage peut être utilisé à la fois pour l'enseignement et pour l'étude de divers aspects d'un circuit allant du système sensoriel au système nerveux central, puis aux motoneurones et aux muscles. Cette série d'expériences illustre la facilité d'utilisation du modèle d'écrevisse pour aborder des questions relatives à l'intégration et à la transmission synaptiques, au potentiel membranaire, ainsi qu'aux différences structurelles entre les types de fibres musculaires.

Les principaux avantages de l'utilisation de la préparation de l'écrevisse pour enseigner les concepts et techniques en électrophysiologie sont la facilité de la dissection, la viabilité de la préparation dans un milieu salin minimal, la facilité d'obtention des réponses synaptiques et la clarté de l'organisation anatomique globale des muscles. Ces techniques peuvent également être appliquées à d'autres préparations et permettront d'approfondir notre compréhension de la physiologie et de la modulation synaptiques, ainsi que des différences biochimiques et structurales dans la préparation présentée. Pour commencer la chirurgie, sélectionnez une écrevisse d'environ six à dix centimètres de longueur corporelle et placez-la dans de la glace pilée pendant cinq minutes afin de l'anesthésier. Pour décapiter l'écrevisse, tenez-la par l'arrière de la tête en veillant à garder vos doigts hors de portée des pinces et de la bouche de l'animal à l'aide de grandes ciseaux.

Retirer rapidement la tête en effectuant une coupe nette juste derrière les yeux de l'écrevisse, puis enlever les pattes et les pinces de l'écrevisse afin d'éviter toute blessure. Retirer les styles chez les mâles ainsi que les petites nageoires chez les mâles et les femelles. Jeter la tête et les appendices.

Ensuite, séparez l'abdomen du thorax en effectuant une incision le long de la membrane articulaire qui relie l'abdomen et le thorax. Conservez la partie abdominale de l'écrevisse et jetez le thorax ; orientez légèrement les ciseaux vers le côté ventral et, selon un angle, pratiquez une incision dans la carapace le long de la bordure latérale inférieure de chaque côté de l'abdomen. Veillez à ne pas pénétrer trop profondément dans l'écrevisse.

Suivez le motif naturel des lignes de la carapace de l'écrevisse qui s'étendent sur toute la longueur de chaque segment à l'aide de pinces. Retirez la partie ventrale de la carapace en la tirant vers le haut et vers l'arrière, en prenant soin de ne pas endommager les muscles abdominaux.

Retirez les muscles fléchisseurs. À ce stade, une masse blanche de tissu peut être observée au-dessus des muscles fléchisseurs profonds. Enlevez soigneusement ce tissu à l’aide d’une pince.

Le tube digestif est désormais visible sous la forme d'un petit tube courant le long de la ligne médiane des muscles fléchisseurs profonds. Retirez-le en le pinçant avec une pince à son extrémité supérieure et en le tirant vers l'extérieur de l'abdomen. Coupez la partie inférieure du tube digestif à l'extrémité de la queue.

Rincez la préparation avec du sérum physiologique afin de vous assurer que les déchets fécaux n'interfèrent pas avec celle-ci. À l'aide d'épingles de dissection, fixez les coins supérieur et inférieur de la préparation sur une boîte de Pétri revêtue d'une couche S. Les muscles extenseurs abdominaux sont désormais exposés.

Verser la solution saline dans la boîte de Pétri pour recouvrir la préparation jusqu'à ce que les enregistrements intracellulaires soient effectués. Déplacer la boîte de Pétri vers le microscope et utiliser de la cire sous la boîte pour l'empêcher de bouger. L'appareil utilisé pour les enregistrements intracellulaires est illustré dans cette figure.

Les connexions et réglages appropriés sont indiqués dans le texte accompagnant. Configurez le logiciel de tableau de laboratoire conformément aux instructions. Dans le texte accompagnant, placez le fil de masse dans le bain salin.

Placer l'extrémité d'une micropipette en verre remplie de chlorure de potassium à trois molarités dans le bain salin et mesurer la résistance de l'électrode. La résistance de l'électrode doit être comprise entre 20 et 60 mégohms. Utiliser le bouton grossier de l'amplificateur pour déplacer la ligne sur le diagramme du laboratoire jusqu'à zéro sous une illumination intense.

Observer au microscope et identifier les muscles DEM longitudinaux. Utiliser la sonde électrode pour insérer l'électrode intracellulaire dans une fibre musculaire du muscle DEM. L'électrode doit être insérée juste assez pour pénétrer dans la fibre musculaire.

Veillez à ne pas pénétrer complètement la cellule. Mesurez l'amplitude du potentiel de repos. Faites glisser le curseur M sur la trace à partir de l'emplacement situé en bas à gauche de la fenêtre du graphique.

Placez le marqueur M sur la ligne de base et déplacez le curseur jusqu'au point le plus bas du signal enregistré. La différence entre le marqueur et le curseur actif s'affiche dans le coin supérieur droit de l'écran. Cette valeur correspond à la tension du potentiel de membrane au repos.

Divisez la tension enregistrée par le facteur d'amplification, dans ce cas un facteur de 10 a été utilisé. Ensuite, convertissez la tension des volts en millivolts. Après avoir enregistré le potentiel de repos de cette fibre musculaire, observez à travers le microscope et retirez soigneusement l'électrode de la fibre musculaire.

Répétez l'enregistrement intracellulaire sur d'autres fibres musculaires. La prochaine partie de cette expérience permettra de surveiller l'effet d'une augmentation de la concentration extracellulaire de potassium sur la membrane au repos. Six solutions salines de crevette seront utilisées avec des concentrations de potassium de 5,4, 20, 40, 60, 80 et 100 millimolaires.

Choisissez un muscle qui ne tressaille pas pour effectuer l'enregistrement intracellulaire suivant entre les enregistrements. Remplacez la solution de bain par la solution de chlorure de potassium de concentration immédiatement supérieure. Veillez à recouvrir complètement la préparation à chaque fois.

Enregistrez les variations du potentiel membranaire pour chaque solution. L'effet de l'augmentation de la concentration extracellulaire de potassium, le potentiel membranaire est illustré sur ce tracé issu d'une capture d'écran montrant les potentiels membranaires au repos pour chaque concentration de potassium, représentés sur un graphique semi-logarithmique de la concentration extracellulaire de potassium en fonction du potentiel membranaire. Alignez le potentiel de repos à une concentration extracellulaire de potassium de 5,4 millimolaire.

Pour les courbes hypothétique et observée, comparez la pente de la droite observée à celle de la droite hypothétique. Après avoir terminé ces enregistrements électrophysiologiques, l'étape suivante consiste à examiner l'anatomie des fibres musculaires et leur schéma d'innervation. Transférez le montage dans la boîte de culture et ajoutez du bleu de méthylène.

Après cinq minutes, retirez le bleu de méthylène et ajoutez du sérum physiologique frais pour écrevisse. Recherchez le nerf principal qui innerve les muscles au sein d'un segment. Esquissez le schéma d'innervation des muscles S-E-M-D-E-L 2D EL un et DEM dans un segment.

Ensuite, déplacer le prélèvement sous une hotte. Éliminer la solution saline et ajouter le fixateur. Le fixateur utilisé ici est une solution poin.

Le but de la hotte aspirante est d'éviter les vapeurs du fixateur. Soyez très prudent pour ne pas laisser cette solution entrer en contact avec votre peau ou vos yeux. Si vos yeux commencent à brûler, rincez-les immédiatement à la station de lavage oculaire.

Laisser la solution de boin agir sur le préparat pendant environ 10 minutes, puis utiliser une pipette pour remplacer la solution par du sérum physiologique. Découper un fin segment du muscle DEL un ou DEL deux. Le placer sur une lame de verre.

Étiquetez la lame. Répétez la procédure pour le muscle SEM. Utilisez le microscope composé pour observer le motif de bandes des sarcomères dans les deux préparations tissulaires.

La série suivante d'expériences examinera comment enregistrer les réponses synaptiques dans les muscles abdominaux d'écrevisse. Sélectionnez une autre écrevisse, décapitez-la. Retirez le thorax et les appendices, puis exposez les muscles extenseurs abdominaux comme indiqué dans la chirurgie.

Dans la première section de cette vidéo, utilisez le microscope pour localiser le nerf transportant les axones moteurs vers les muscles extenseurs. Recherchez le segment présentant le nerf le plus accessible. Le nerf est blanc et peut être observé en utilisant une pipette pour pulvériser du sérum physiologique sur la préparation ou en soufflant légèrement sur celle-ci.

Cela provoque le déplacement du nerf et facilite ainsi son identification. Placer l'électrode d'aspiration, tenue par le micromanipulateur, directement au-dessus du nerf. Tirer doucement sur la seringue pour attirer le nerf à l'intérieur de l'électrode.

Vous pouvez observer le nerf aspiré dans l'électrode à travers le microscope. Ajustez les paramètres dans le logiciel LabChart comme indiqué dans l'article accompagnant. Remplissez une microélectrode en verre avec une solution de chlorure de potassium à trois molarités et connectez-la à l'étage de tête et au PowerLab.

Utilisez le bouton grossier de l'amplificateur pour déplacer la ligne sur le graphique du laboratoire jusqu'à zéro. Avant d'insérer l'électrode, le bouton bascule doit être activé puis désactivé plusieurs fois. Afin de tester la résistance de l'électrode, mesurez l'amplitude des valeurs obtenues.

Observer à travers le microscope et utiliser la sonde électrode pour insérer l'électrode dans l'une des fibres musculaires longitudinales, soit la DEM, soit la DL une ou la DL deux. Veiller à ne pas traverser complètement la fibre musculaire. La préparation est désormais prête pour l'expérience.

L'électrode d'aspiration est utilisée pour stimuler le faisceau nerveux segmentaire et l'électrode microscopique en verre sert à enregistrer la réponse synaptique de la fibre musculaire en déclenchant le stimulateur de greffe afin de stimuler le nerf à un hertz pour obtenir des réponses phasiques. Ensuite, placer l'électrode dans une fibre musculaire SEL. Le SEL est un muscle tonique.

Stimulez le nerf avec de courtes salves d'impulsions à 10 hertz pour obtenir des réponses toniques. Comparez les réponses enregistrées des muscles DEL et SEL. Notez que les muscles phasiques DEL présentent des réponses synaptiques d'amplitude plus grande que les muscles toniques SEL.

Cette série d'expériences se concentre sur les muscles fléchisseurs de l'écrevisse plutôt que sur les muscles extenseurs. À l'aide d'une nouvelle écrevisse, isolez l'abdomen comme indiqué dans cette intervention chirurgicale. Dans la première partie de cette vidéo, placez la préparation de queue isolée dans une boîte de Pétri remplie de solution saline, puis fixez la queue et la partie supérieure de la préparation à l'aide d'épingles.

Remarquez que pour les expériences de dec Caro sur les muscles fléchisseurs toniques, le cordon nerveux ventral doit rester intact. Utilisez un scalpel pour entamer une incision longitudinale à travers la membrane articulaire entre deux côtes sur la face ventrale de la préparation. Soyez très prudent de ne pas couper trop profondément lors de cette incision, car une incision profonde pourrait sectionner la racine du nerf moteur, ce qui garantit que les muscles superficiels ne sont pas endommagés.

Effectuez l'étape suivante. En regardant à travers un microscope, utilisez des ciseaux ou un scalpel pour effectuer une incision horizontale à partir de l'incision longitudinale dans la fine couche membranaire recouvrant le muscle. Élargissez l'incision afin de créer un lambeau de membrane articulaire et soulevez le lambeau vers le haut.

Utilisez des ciseaux pour découper le lambeau afin d'exposer les muscles fléchisseurs superficiels en vue d'un enregistrement intracellulaire à partir de ces muscles. Utilisez le même instrument et le même dispositif que ceux utilisés pour enregistrer le potentiel de membrane au repos et les réponses synaptiques provenant des extenseurs abdominaux. Comme précédemment, utilisez une électrode intracellulaire remplie de chlorure de potassium à trois molaire.

Insérez l'électrode dans une fibre musculaire des muscles fléchisseurs superficiels, en prenant soin de ne pas traverser le muscle. Enregistrez l'activité spontanée des PPSÉ. Notez les différentes amplitudes des PPSÉ et observez la présence éventuelle de PPSI.

Prenez un petit pinceau et brossez délicatement le long du bord de la cuticule dans le même segment contenant l'électrode d'enregistrement. Notez tout changement de fréquence ou d'amplitude des PSEP dû à la stimulation si une réponse plus importante est observée. Cela indiquerait le recrutement de neurones moteurs supplémentaires répondant à la variation de l'activité des nerfs sensitifs.

Échangez soigneusement la solution saline du bain contre une solution contenant un neuromodulateur tel qu'une micromolaire de sérotonine ou une saline saturée en dioxyde de carbone. Répétez ensuite la stimulation au pinceau. Notez l'effet du changement de solution de bain sur l'activité enregistrée.

Remettez la solution saline de bain à la solution saline normale et observez que l'activité de la fibre musculaire revient à la ligne de base. Cette figure montre des PPSÉ enregistrés dans une fibre musculaire fléchisseuse superficielle. Remarquez les tailles différentes des PPSÉ.

L'étape suivante de cette expérience utilise une électrode extracellulaire pour enregistrer les potentiels d'action des motoneurones répondant à l'activité dans le circuit nerf sensitif vers SNC puis motoneurone. Commencez par fabriquer une électrode de succion pour stimuler les nerfs sensitifs. Tirez un morceau de tube en plastique au-dessus d'une flamme.

L'étape suivante consiste à couper le tube à la taille souhaitée. Pour ce faire, vous devez examiner le nerf dans votre préparation afin d'estimer le diamètre d'ouverture souhaité pour votre électrode de succion. Selon la taille de l'écrevisse, les faisceaux nerveux peuvent varier en taille, allant d'environ un millimètre à quelques millimètres de diamètre.

Coupez la section étirée du tube afin que l'ouverture à l'extrémité ait la taille appropriée pour maintenir le nerf. Si l'ouverture est trop grande, le nerf pourrait tomber. Si l'ouverture est trop petite, le nerf pourrait être endommagé par la pression de l'électrode.

Placer le tube en plastique sur l'extrémité d'une électrode en verre à suc. Le montage pour l'électrophysiologie et le logiciel diffère légèrement selon qu'on enregistre des réponses extracellulaires ou qu'on mette en place des enregistrements intracellulaires. À l'aide du matériel spécifié dans l'article associé, aspirer la troisième branche nerveuse qui innerve le muscle fléchisseur superficiel dans l'électrode de succion.

Vous pouvez désormais commencer à enregistrer les potentiels d'action. Ce trajet comporte cinq motoneurones excitateurs et un motoneurone inhibiteur. Après avoir enregistré l'activité de base, stimulez la cuticule à l'aide d'un pinceau afin d'observer la modification des potentiels d'action générés.

Ensuite, remplacer la solution de bain par des neuromodulateurs tels que la sérotonine, comme dans l'expérience précédente, et enregistrer tout changement de réponse. Des exercices supplémentaires sont proposés dans le texte accompagnant. Cet enregistrement montre les potentiels d'action enregistrés à partir de la troisième voie avant et pendant la stimulation de la cuticule à l'aide d'un pinceau ; comparer la fréquence des potentiels d'action avant le brossage à leur fréquence pendant la stimulation.

Cet enregistrement montre les potentiels d'action enregistrés à partir de la troisième voie dans une solution saline normale et dans une solution de sérotonine. Comparez la fréquence des potentiels d'action dans la solution saline normale à leur fréquence en présence de sérotonine, comme vient d'être montré. Le brossage augmente la fréquence de décharge par rapport à la ligne de base.

L'activité démontrée également est que la sérotonine augmente la fréquence de décharge par rapport à la solution saline normale. Cette figure montre que lorsque le brossage et la sérotonine sont combinés, l'augmentation de la fréquence de décharge est encore plus importante. La comparaison des effets externes et théoriques de la concentration en potassium externe sur le potentiel de membrane au repos indique l'influence des ions sur le potentiel de membrane.

Nous vous avons également montré comment enregistrer les réponses ntic aux jonctions neuromusculaires des muscles phasiques et toniques. Ces techniques peuvent être utilisées dans des laboratoires pédagogiques destinés à l'investigation afin d'enseigner des concepts fondamentaux et la physiologie. Les techniques acquises lors de cet exercice de laboratoire peuvent servir à répondre à des questions liées à d'autres préparations expérimentales, ainsi qu'à des applications physiologiques en rapport avec la médecine et la santé.