L'expérimentation physiologique avec l'intestin postérieur écrevisses: un exercice de laboratoire étudiant

L'objectif général de ce rapport est de servir d'outil pédagogique pour les élèves de niveau avancé au lycée et les étudiants du premier cycle universitaire inscrits à des cours de physiologie qui participent à des expérimentations physiologiques. Les étudiants apprennent à exposer et à enregistrer les contractions de l'intestin postérieur de l'écrevisse. Une étape supplémentaire consiste à exciser l'intestin postérieur de l'animal, ce qui permet l'application directe de composés.

Ensuite, la force et le rythme des contractions du muscle lisse de l'intestin postérieur sont surveillés tout en appliquant divers agents pharmacologiques afin d'examiner les mécanismes qui modifient l'intensité de la contraction. Des résultats sont obtenus, montrant l'action de modulateurs soit sur l'innervation nerveuse, soit directement sur le muscle, selon des dosages pharmacologiques et un sous-typage des récepteurs. Bonjour, je suis le Dr J. Mercier du Département des sciences biologiques de l'Université Brock.

J'utilise depuis longtemps l'intestin postérieur de l'écrevisse comme préparation pour mener des recherches sur les neurotransmetteurs qui contrôlent les muscles viscéraux. J'utilise également cette préparation comme outil pédagogique, et dans le cadre d'une collaboration avec le laboratoire du Dr Robin Cooper à l'Université du Kentucky, nous perfectionnons plusieurs expériences réalisées par les étudiants à des fins d'enseignement. Cette méthode peut fournir des informations sur la fonction de l'intestin postérieur de l'écrevisse.

Il peut également être appliqué dans des études de maladies telles que celles impliquant des rythmes péristaltiques. Il peut aussi être utilisé pour décrire les mécanismes sous-jacents à la modulation de l'innervation musculaire et neuronale. Les étudiants apprendront à interpréter des données physiologiques et pharmacologiques à l'aide d'agents pharmacologiques, de neurotransmetteurs et de neurohormones, et acquerront une compréhension générale du fonctionnement des récepteurs.

En ce qui concerne les agonistes et les antagonistes, les étudiants établiront des courbes dose-réponse et présenteront les données sous forme graphique pour une analyse statistique. Pour anesthésier l'animal, placez un écrevisse mesurant de six à dix centimètres de longueur corporelle sur de la glace pendant cinq à dix minutes. Tenez l'écrevisse anesthésiée par-derrière les pinces avec une main. Coupez rapidement de l'orbite oculaire jusqu'au milieu de la tête des deux côtés, puis décapitez l'écrevisse.

Le sang du spécimen sera collant lors de la préparation, il faut donc laver les outils une fois l'opération terminée. Ensuite, coupez les pattes et les pinces. Puis retirez les nageoires caudales gauche et droite, en laissant la nageoire caudale médiane, et incisez le long du côté dorsal de l'abdomen jusqu'au dernier segment.

Ensuite, coupez le long du dernier segment et descendez de l'autre côté. Retirez la carapace dorsale. Placez l'écrevisse disséquée dans la boîte de Pétri doublée de papier absorbant.

Sérum physiologique pauvre pour écrevisses. Pour recouvrir la préparation, utilisez des épingles de dissection afin de fixer celle-ci sur la boîte de Pétri. L'intestin postérieur est généralement entouré par un réseau de vaisseaux sanguins et de tissu conjonctif.

Retirez-les avec des pinces en prenant soin de ne pas endommager l'intestin. L'intestin postérieur est désormais visible le long de l'abdomen.

Laisser le préparat de crevette disséquée reposer dans la solution saline pendant environ 10 minutes afin qu’il puisse se remettre du choc de la dissection et de l’exposition à la solution saline. Observer les contractions péristaltiques lentes de l’intestin postérieur. Pour commencer, la fréquence des contractions peut désormais être calculée.

Comptez le nombre de contractions survenant en 30 secondes et enregistrez-le dans un journal de bord. Notez également le type de contractions observées et indiquez s’il s’agit de contractions péristaltiques ou spasmodiques. Précisez le sens de propagation des éventuelles ondes péristaltiques.

Comptez la fréquence des contractions près de l'anus et à mi-longueur de l'abdomen, et vérifiez s'il existe des différences de fréquence entre ces deux régions. Préparez une variété de solutions de test, toutes à la même température que la solution saline de bain. La première solution testée ici sera de la sérotonine à un micromolaire, préparée dans de la saline pour écrevisse.

À l’aide d’une pipette, retirez la solution saline de la cavité de l’abdomen exposé de l’écrevisse et appliquez directement la solution de sérotonine à une micromolaire sur l’intestin postérieur. Immédiatement après l’ajout de la nouvelle solution, attendez 30 secondes, puis comptez les contractions sur une durée de 30 secondes dans la région proche de l’anus, puis comptez les contractions des 30 secondes suivantes au milieu de l’abdomen. Notez ces valeurs dans un tableau et indiquez également le type de contractions observées. Suivant.

Versez la solution d'essai hors de la cuve d'enregistrement et rincez l'intestin postérieur plusieurs fois avec du sérum physiologique normal pour écrevisse. Rincez ensuite le prélèvement toutes les 30 secondes pendant cinq minutes. À ce stade, vous pouvez ajouter la solution d'essai suivante, qui, dans cette démonstration, est de l'Topamine à une micromolaire.

Enregistrez vos observations comme précédemment et répétez ce processus pour les composés test restants. Lorsque vous utilisez plusieurs concentrations d'une même substance, veillez à commencer par la concentration la plus faible puis à passer aux concentrations plus élevées. Le montage permettant de mesurer la force des contractions de l'intestin grêle comprend un ordinateur portable équipé du logiciel Lab Chart 7, le Bridge Pod, le PowerLab 26T et le transducteur de force.

Avant de pouvoir mesurer la force des contractions musculaires du tube digestif, vous devez isoler le tractus gastro-intestinal. Pour ce faire, découpez les muscles du dernier segment abdominal, insérez deux épingles ou plus à travers la cuticule ventrale molle de chaque côté de l'anus, puis retirez le reste de l'abdomen, en laissant le tube digestif postérieur et l'anus attachés à un petit morceau de cuticule. Le tube digestif doit être sectionné près de la jonction entre le thorax et l'abdomen.

Déplacez maintenant le tube digestif vers une coupelle peu profonde dont le fond est recouvert de sard. Un vaisseau sanguin parcourt l'aspect dorsal du tube digestif. Écartez-le soigneusement du tube digestif.

Appliquez une solution saline fraîche pour écrevisses sur le montage. Déplacez le transducteur de force au-dessus du montage. Examinez attentivement la broche fixée au bas du transducteur de force.

L'extrémité qui s'accroche à l'intestin présente une légère courbure. Accrochez la légère courbure de l'épingle à l'extrémité coupée de l'intestin postérieur. Après avoir accroché l'intestin postérieur, déplacez légèrement la boîte jusqu'à ce que l'intestin postérieur soit tendu.

Soignez cette étape car l'intestin doit être tendu, mais pas trop. Un excès de tension pourrait endommager le muscle. Lorsque la boîte est en position optimale, utilisez de la cire ou de l'argile pour maintenir la boîte en place.

Ensuite, lancez le logiciel. Pour commencer l'enregistrement, ouvrez le logiciel LabChart. Fermez LabChart et le centre d'accueil.

Allez dans la configuration en haut à gauche. Cliquez sur les paramètres de canal en bas à gauche. Modifiez les paramètres de canal pour n'avoir qu'un seul canal.

Cliquez sur OK à droite de l'écran. Allez au canal un, ouvrez le module de pont. Réglez la plage sur le réglage le plus sensible, 200 microvolts dans ce cas, en haut du graphique dans le coin droit.

Régler les cycles par seconde sur 2K. Vous êtes maintenant prêt à enregistrer. Cliquez sur démarrer pour vous assurer que le dispositif fonctionne correctement.

Effleurez légèrement la pointe du transducteur avec une pipette. Vous devriez observer un changement de force enregistré par le logiciel. Cliquez sur arrêter dans le logiciel, puis cliquez sur démarrer et laissez le programme s'exécuter.

Pendant environ 20 secondes, cliquez sur arrêt et ajoutez un commentaire intitulé saline. Calculez uniquement la fréquence des contractions en mesurant le temps entre le début d'une déviation et le début de la suivante, ou en comptant le nombre total de déviations sur une ou deux minutes. Exprimez la fréquence en contractions par minute ou en contractions par seconde, selon la rapidité avec laquelle elles se produisent.

Pour mesurer la force des contractions, utilisez une mesure relative afin de comparer les contractions dans différentes conditions à partir du fichier enregistré. Déplacez le marqueur M jusqu'à la ligne de base, puis déplacez le curseur jusqu'au sommet de la déviation et notez la valeur indiquée en haut à droite de l'écran. Il s'agit d'une valeur delta, correspondant à la différence entre M et le sommet.

Remarquez que le curseur doit rester immobile au sommet afin de mesurer le changement. Ensuite, déplacez le marqueur M et le curseur vers la prochaine forme d'onde d'intérêt et répétez la mesure pour examiner l'effet des modulateurs. Sur ce montage, changez lentement la solution saline pour une solution de test.

Dans ce cas, ajouter un micromolaire de sérotonine et continuer l'enregistrement de la fréquence et de l'amplitude des contractions comme dernier test. Pour ce test de préparation, vérifier si les inhibiteurs des jonctions communicantes modifient la fréquence ou l'amplitude des contractions ; les inhibiteurs des jonctions communicantes comprennent un héptanol ou du sérum physiologique qui a été saturé en dioxyde de carbone. Ces composés sont utilisés en dernier car ils peuvent endommager les fibres musculaires après une exposition prolongée. Pour comparer l'effet des différents composés, représenter les données sur un graphique.

Une autre utilisation intéressante de ce prélèvement consiste à enregistrer la force générée par les muscles circulaires. Toutefois, si vous avez appliqué des inhibiteurs des jonctions communicantes à votre prélèvement, ces inhibiteurs peuvent avoir endommagé les muscles circulaires ; dans ce cas, vous devez utiliser un nouveau prélèvement de tube digestif postérieur pour tester les muscles circulaires. Pour exposer les muscles circulaires, incisez longitudinalement le tube intestinal à l’aide de fines ciseaux.

Utilisez des épingles fines pour fixer solidement un côté sur la boîte. Fixez l'épingle crochue du transducteur à l'autre extrémité du fragment. Exposez la préparation aux mêmes composés qui ont été testés sur les muscles longitudinaux ; la relation entre les composés testés et le nombre ainsi que le type de contractions est indiquée ici.

Vous pouvez représenter graphiquement le nombre de contractions en fonction du temps pour les solutions de sérum physiologique, de sérotonine et de glutamate. Vous pouvez également tracer le nombre de contractions en fonction de la force des contractions en millivolts pour les solutions de sérum physiologique, de sérotonine et de glutamate. Ces graphiques peuvent être réalisés pour les muscles longitudinaux et circulaires afin de tester si les muscles longitudinaux et circulaires des différentes régions de l'intestin présentent des réponses différentes aux divers modulateurs.

Les expériences ci-dessus peuvent être répétées sur différentes régions allant de l'anus vers le haut le long de l'abdomen. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de faire attention à ne pas endommager le tube digestif avec la pince et à ne pas tirer trop fort avec le transducteur de force après cette procédure. D'autres méthodes, telles que les enregistrements électrophysiologiques du muscle, peuvent être effectuées afin d'étudier d'autres aspects, comme les fonctions et les modulations des canaux ioniques, et peuvent servir de modèle pour d'autres tissus dans d'autres modèles animaux.