Méthodes pour les enregistrements patch clamp Capacité du calice

Bonjour, je m'appelle Ken Paradiso. Je travaille pour Ling Gang Wu au sein du programme intramural de l'Institut national des troubles neurologiques et de l'AVC, situé sur le campus de Bethesda aux NIH. Je vais vous montrer les techniques utilisées pour l'enregistrement présynaptique en configuration whole-cell par la méthode du patch-clamp.

Pour préparer le tissu cérébral, nous retirons le cerveau du rat. Nous plaçons le cerveau dans cette solution, qui doit être glacée et pauvre en calcium, et nous la saturons en carbogène afin de garantir un apport constant en oxygène au cerveau. Elle doit également être maintenue à basse température pour minimiser la DA, c’est-à-dire réduire au minimum le degré de dommages.

Le cerveau se trouverait donc maintenant dans cette solution. On l'en sortirait, on le découperait de manière appropriée afin de pouvoir le placer sur le bloc, puis on le monterait sur le bloc avec du Sano correlate ou de la colle forte, mais on remplirait alors la chambre avec une solution froide, pauvre en calcium, on la bornerait d'air, on la placerait sur le vibrotrancheur, puis on découperait des tranches d'une épaisseur de 180 à 190 micromètres, avec une fréquence de lame de 70 hertz et une vitesse d'avancement vers l'avant de 0,01 à 0,02 millimètre par seconde. Cela correspondrait donc à 10 à 20 micromètres par seconde.

Une fois chaque tranche réalisée, nous transférons les tranches du sérum physiologique glacé vers cette chambre, qui contient une solution normale au calcium. Il s'agit de la même solution dans laquelle nous effectuons les enregistrements, maintenue à la température physiologique de 37 degrés. Nous plaçons ensuite les tranches ici pour la récupération.

Il reste ici pendant une demi-heure à une heure avant la réalisation des expériences de physiologie. Ici, j'ai le cerveau et je vais le sortir de la solution. Il s'agit donc d'un cerveau plus gros à des fins de démonstration.

Ceci provient d'un rat P20. Nous allons le retourner. C'est le tronc cérébral qui nous intéresse.

Donc, cette zone située ici-bas et le calice qui est maintenu se trouvent à peu près dans cette région précise. Nous allons donc découper le reste du cerveau, isoler le tronc cérébral, puis préparer le tronc cérébral pour la chambre de sectionnement. Très bien, nous allons donc trancher le reste du cerveau afin d'isoler uniquement le tronc cérébral.

Je vais le retourner pour montrer où nous en sommes. Normalement, nous ne ferions pas cela de cette manière, et encore une fois, nous pouvons simplement supprimer toute cette partie. En le retournant à nouveau, nous avons isolé le tronc cérébral et nous allons effectuer une autre incision juste à cet endroit.

D'accord, c'est terminé. Voici le tronc cérébral. La calotte de Held se trouve à peu près ici et là.

Voici le tronc cérébral. Encore une fois, nous allons le repousser légèrement. Nous allons couper un côté du cervelet, ce qui permettra au tronc cérébral de se positionner sur le côté, comme ceci.

Nous ajoutons un peu de colle acrylique Sano et, en la maintenant allongée sur le côté, nous la remplissons rapidement de glace froide, puis d'une solution froide à faible teneur en calcium. Nous insérons la ligne d'oxygène dès que possible. Nous la prenons ensuite et la transportons vers le vibratome.

Nous avançons rapidement pour atteindre le début du cerveau, puis, une fois arrivé au début du cerveau, nous réduisons la vitesse à 0,01 millimètre par seconde. Cela correspond à 10 micros par seconde. Le déplacement s'effectue donc à une vitesse incroyablement lente.

La première partie du cerveau est la partie qui possède le mtb, c’est-à-dire le noyau médial du corps trapézoïde. Et c’est la partie qui contient, d’accord, donc une fois que je l’ai dans la pipette de transfert, j’essaie de le rapprocher au maximum de l’extrémité de la pipette. Et voici la tranche de cerveau que je transfère assez rapidement dans cette chambre, qui contient une solution d’enregistrement standard avec des concentrations normales de calcium et une température plus élevée.

Et cela permettra aux tranches de se rétablir après les procédures de découpe, afin qu'elles soient prêtes pour les expériences de physiologie. Très bien, à partir de maintenant, ce sera la même chose à répétition. L'équipement suivant est celui que j'utiliserai pour effectuer le patch-clamp.

Nous disposons d'un microscope droit à plateau fixe. Le plateau est fixe, comme je l'ai dit, donc le microscope se déplace sous celui-ci à l'aide d'un manipulateur. Nous utilisons un manipulateur micrométrique Wigs et Newman pour maintenir le plateau, ainsi que l'étage d'entrée de l'amplificateur, et nous utilisons un amplificateur de patch-clamp EPC 10 de HECA.

Ce que j’aurais également dû mentionner, c’est que nous utilisons la microscopie à contraste d’interférence différentielle (DIC) avec de la lumière infrarouge. Nous disposons donc d’une caméra IR ici, et tout ce que nous voyons sera affiché à l’écran lorsque nous recherchons les CAE. L’amplificateur de patch-clamp est contrôlé par un logiciel appelé Pulse, provenant également de Heca, qui commande l’amplificateur et l’ensemble de l’expérience de physiologie.

Les résultats apparaîtront sur cet écran. Le calyce possédant une terminaison présynaptique de grande taille, celle-ci nous permet de réaliser une impalement physique sur la terminaison. Nous pouvons ainsi obtenir des enregistrements présynaptiques, ce qui constitue un avantage particulier, notamment dans le système nerveux central.

Cela nous permet donc de mesurer les canaux calciques activés en amont présynaptiquement. Nous pouvons également mesurer l'activité des potentiels d'action si nous souhaitons stimuler le nerf qui mène au calice. Ce que nous faisons dans ce laboratoire, c'est mesurer un processus appelé exocytose, qui correspond à la fusion de vésicules contenant un neurotransmetteur avec la membrane.

Or, lors de la fusion de ces vésicules avec la membrane lors du processus appelé exocytose, de la membrane est ajoutée au terminal synaptique, ce que nous pouvons mesurer sous forme de variation de capacité. Nous observons une augmentation de la capacité lorsque de la membrane est ajoutée au terminal ; ainsi, les expériences que je vais présenter aujourd'hui consistent en des mesures de capacité effectuées en pré-synaptique lors de la suppression de membrane. Il n'est donc pas possible d'ajouter indéfiniment de la membrane ; bien entendu, il faut également en retirer une partie.

Ce processus est appelé endocytose ou absorption membranaire. Nous pouvons également le mesurer, et cela se traduira par une diminution du niveau de capacité, dont nous montrerons des exemples ultérieurement. Ce que cela nous permet maintenant de faire, c'est de surveiller l'activité des canaux calciques ainsi que certains des protéines impliquées dans l'exocytose et l'endocytose, et de les étudier.

Nous pouvons introduire des peptides afin de bloquer les protéines impliquées dans l'exocytose ou l'endocytose. Nous pouvons également utiliser des toxines qui ont le même effet. Il est également possible de réguler les quantités de calcium pénétrant dans la terminaison, ce qui permet d'étudier précisément le processus d'exocytose, la libération du neurotransmetteur, ainsi que la prise en charge de la membrane qui suit cet événement.

Il s'agit du tube contenant notre solution d'enregistrement intracellulaire. Nous la préparons à l'avance, puis nous la congelons et nous pouvons généralement l'utiliser pendant plusieurs semaines à un mois avant de devoir préparer une nouvelle solution. Encore une fois, nous pensons immédiatement avant d'effectuer nos enregistrements, et vous allez toujours récupérer une certaine quantité de particules de poussière ou d'autres types de débris qui vont pénétrer dans votre tube.

Vous pouvez faire l'une des deux choses suivantes. Vous pouvez soit prélever la solution et la filtrer, soit la centrifuger pendant une ou deux minutes, puis prélever la solution en laissant une fraction inférieure contenant les débris et d'autres matériaux. Je préfère donc la centrifuger, et c'est ce que je vais faire maintenant.

Donc, ceci est le tube contenant notre solution intracellulaire. Elle est décongelée. Nous allons la centrifuger pendant environ deux à trois minutes dans une petite centrifugeuse, ce qui devrait suffire à éliminer les particules de poussière les plus grosses de la solution.

Je prélève donc simplement la phase supérieure, la solution que nous venons de centrifuger, en prenant soin de ne pas l'agiter, et je la transfère dans un tube propre, en prélevant environ 90 % de cette solution. J'essaie encore une fois d'éviter de récupérer la dernière petite quantité. Je m'arrête donc juste à cet endroit.

J'ai immédiatement placé ceci sur de la glace afin que cela reste bien froid pendant l'expérience. C'est très important. Ceci est, ceci est l'une de nos pipettes.

Nous utilisons ceci pour les enregistrements intracellulaires. Il s'agit de verre de silice à paroi épaisse et à alvéole, de deux millimètres de diamètre extérieur et de 1,16 millimètre de diamètre intérieur. Premièrement, nous remplissons la pipette par l'arrière.

Nous appliquons donc une aspiration : nous plaçons la pipette dans la solution d’enregistrement et appliquons une aspiration afin de remplir l’extrémité très fine de la pipette, qui ne se remplirait par aucun autre moyen. Une fois cette étape réalisée, nous prenons un tube capillaire et remplissons le reste de l’électrode en accédant par l’arrière de la pipette. Il s’agit d’une technique physiologique classique, effectuée en donnant littéralement une petite pichenette.

Vous risquez de casser l'extrémité de la pipette, mais vous aurez également, si vous n'agissez pas ainsi, souvent des bulles d'air. Bon, nous la plaçons maintenant sur notre support de pipette, qui est relié à l'étage d'entrée de l'amplificateur de patch-clamp. Un fil en chlorure d'argent s'y trouve.

Le fil de chlorure d'argent entre en contact avec la solution intracellulaire, ce qui nous permet de mesurer l'activité électrique dans la terminaison présynaptique. Nous recherchons donc la tranche qui contient un grand nombre de CAE. Nous souhaitons une forte densité de CAE.

Donc, nous recherchons le noyau médial du corps trapézoïde, appelé MNTB, qui est l'endroit où se trouve la terminaison, formant la calotte calyciforme, ou encore le calyce, comme on l'appelle. Ainsi, nous commençons par balayer la coupe. Par exemple, ici, nous avons un calyce situé un peu en profondeur par rapport à la surface, et il n'y a pas grand-chose à patcher ; nous continuons donc simplement à balayer la zone.

Donc, ceci est un calice ici que nous visons. J'ai fait deux marques à l'écran, qui indiquent l'endroit où la pipette va aller. Et vous pouvez voir qu'il y a le morceau de calice que je vais cibler ; la pipette va descendre.

Je vais appliquer une pression positive afin qu'elle pousse contre le calice, puis je vais relâcher la pression positive. Le calice va alors venir s'appuyer contre la pipette, et à ce moment-là j'applique une aspiration très légère et tente d'aspirer ou de pousser la membrane pour former un scellement entre la membrane et l'extrémité de la pipette. Très bien, la pression positive est relâchée.

Et maintenant, je vais appliquer une aspiration. Nous appliquons ici un pulse de cinq millivolts, ou plutôt de quatre millivolts. Voilà. C'est bon.

Nous diminuons maintenant le potentiel membranaire à moins 80, annulant ainsi le pic transitoire rapide. Nous allons maintenant passer en configuration tout-cellule. J'applique une aspiration douce et j'essaie de percer la membrane.

Ces transitoires de charge indiquent qu'il y a désormais continuité entre la pipette et la cellule, ce qui correspond à un enregistrement en configuration « whole-cell ». C'est encore une belle acquisition. La courbe en rouge clair représente la trace de la capacité, et on peut observer un saut soudain, suivi d'une diminution.

D'accord, je viens de vous montrer les techniques de base permettant d'obtenir des enregistrements à partir d'un terminal présynaptique en calice maintenu. J'ai montré comment produire des tranches contenant le noyau médial du corps trapézoïde. C'est là que vous trouverez les calices maintenus.

J'ai donc présenté les techniques permettant d'examiner les tranches. Vous devez parcourir chacune des tranches afin d'identifier celle qui présente le plus grand nombre de calices en surface. Vous recherchez ensuite la plus grande membrane de calice possible et vous réalisez un enregistrement par électrode à succion dessus.

Et je vous ai également montré les techniques d’enregistrement en configuration de patch, qui sont des techniques d’enregistrement en configuration de patch standard.