Un écran à haut débit pour la bioprospection minière activité cellulase à partir des bibliothèques métagénomique

L'objectif général de cette procédure est d'identifier des clones exprimant la cellulase à partir d'une bibliothèque métagénomique. Cela est réalisé en premier lieu en répliquant une bibliothèque métagénomique préexistante à l'aide d'un robot, suivie d'une incubation de la bibliothèque répliquée à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. La croissance des clones d’e. coli est mesurée, puis un tampon de lyse et un substrat sont ajoutés à la bibliothèque répliquée.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant une activité cellulase par des mesures d'absorbance colorimétrique à l'aide d'un lecteur de plaques. Bonjour, je suis Keith du laboratoire de Steven Hallam, du Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de la Colombie-Britannique. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de criblage fonctionnel à haut débit de bibliothèques métagénomiques.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'activité de la cellulase biomin à partir de bibliothèques métagénomiques. Commençons donc. Avant de commencer ce protocole, préparez une bibliothèque métagénomique conservée dans un format de plaque de 384 puits.

Cette étude a utilisé le vecteur contrôle SMID à une copie PCC en combinaison avec les cellules e coli EPI 300 T1 résistantes à la Farge T1 résistantes comme hôte de la bibliothèque pour démarrer cette procédure, retirez les boîtes contenant la bibliothèque du congélateur à moins 80 degrés Celsius et décongelez-les à 37 degrés Celsius pendant environ 20 minutes. Pendant ce temps, utilisez la fonction de stérilisation par lumière UV du QIX deux pour stériliser le robot pendant 15 minutes. Configurez le Q fill trois conformément aux instructions du fabricant, avec la bouteille de milieu reliée au collecteur via le tuyau stérile du programme.

Remplissez le Q fill three avec la quantité appropriée de milieu et réglez-le pour distribuer un volume de 45 microlitres. Dans chaque puits, purgez l'air des tubulures et du collecteur à l'aide de la fonction de purge du robot jusqu'à ce que le milieu soit visible. À chaque embout du collecteur, remplissez le nombre souhaité de plaques avec du milieu LB à l'aide du Q fill three.

Chaque plaque prend environ 20 secondes à remplir. Ensuite, chargez les plaques de bibliothèque et les plaques neuves dans les zones appropriées des Q picks. Faites remplir robotiquement les bains de nettoyage avec les réactifs appropriés.

2 % micro 90 dans le bain arrière, de l'eau distillée en autoclave dans le bain central et 80 % d'éthanol dans le bain avant. À l'aide du programme de réplication du qix two, sélectionnez la tête appropriée ainsi que le nombre et les types de plaques sources et de plaques de destination. Configurez également la tête pour qu'elle s'auto-nettoie entre chaque réplication.

Généralement, six cycles dans chaque bain suffisent. La capacité de la machine est de 10 plaques à la fois. Réglez la machine pour qu'elle démarre.

La réplication prendra environ 15 minutes. Capacité maximale avec une tête de 384 broches. Une fois les plaques répliquées, incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 24 heures dans une boîte humide.

Le temps d'incubation prolongé est nécessaire car un nombre élevé de copies de smid est induit par l'ajout d'arabinose. Pendant ce temps, nettoyez le robot Q Fill Three comme décrit dans le protocole écrit. Après l'incubation, retirez les plaques de l'incubateur à 37 degrés Celsius.

Mettez de côté les couvercles et placez les plaques sur la plateforme de chargement du magasin fournie avec le système de superposition rapide. Veillez à garder une trace de l'ordre des plaques, car le logiciel ne le fait pas. Les plaques situées au bas de la pile seront lues.

Tout d'abord, retirez un magasin du support rapide. Assurez-vous qu'il est vide et placez-le sur la pile de plaques à lire. Saisissez le magasin par la poignée et la plaque doit s'insérer dans le magasin.

Chargez le chargeur dans le support rapide en respectant l'orientation correcte. Ouvrez le programme de numérisation sur l'ordinateur connecté. Sélectionnez une nouvelle session et attribuez-lui un nom approprié.

Choisissez une plaque 384 puits à fond plat comme plaque. Saisissez dans la zone de disposition de la plaque. Sélectionnez le bouton assistant et choisissez d'ajouter 384 inconnues à la plaque.

Dans la zone du protocole, sélectionnez l'option de boucle de puits et saisissez 384 puits. Une icône de boucle de puits apparaîtra dans l'arborescence de flux située sur le côté gauche de l'écran. Sélectionnez l'icône, puis cliquez pour ajouter une mesure photométrique.

Réglez-le pour lire à 600 nanomètres. Enregistrez le protocole sous un nom unique et fermez le programme de numérisation. Ensuite, ouvrez le programme Polara RS.

Sur la page principale, un tableau répertorie les instruments connectés au dispositif à empilement rapide sous l'intitulé VARI scan ; cliquez sur l'option démarrer la session. La fenêtre d'analyse doit alors apparaître avec un organigramme au centre. Sélectionnez l'élément démarrer la session, puis recherchez le nom de l'analyse enregistrée.

Son réexécution dans le menu déroulant qui apparaît sur le côté droit de l'écran. Une fois le protocole sélectionné, cliquez sur « Exécuter ». Un test s'affichera alors, demandant quelle cartouche utiliser comme source et quelle cartouche est vide.

La boîte inférieure à l'écran correspond au magazine avant du zine. Assurez-vous que la pile rapide et le balayage Vario sont activés, puis cliquez sur démarrer. La pile rapide chargera automatiquement les plaques dans le lecteur de plaques, permettant des mesures continues des plaques.

Observer le chargement du premier plateau dans le scan Vario afin de s'assurer de l'alignement correct des machines pour la lecture. Le balayage de 25 plaques prend environ 50 minutes. Une fois le balayage Barrios terminé, retirer le magasin plein et le placer sur la plateforme de chargement du magasin.

Soulevez le rectangle extérieur de la plateforme et le chargeur doit glisser vers l'extérieur, laissant les plaques debout en pile au centre. Enfin, remettez les couvercles sur les plaques pour un écran en solution. Pour l'activité cellulolytique en premier lieu, préparez le mélange d'essai en utilisant un stock de lyse préparé 10 fois concentré.

Mélanger dans un tampon d'acétate de potassium 50 millimolaire à pH 5,5, comme décrit dans le protocole écrit. Préparer ensuite un stock pouvant atteindre 75 milligrammes par millilitre de substrat chromogène DIPHÉNYL ou DNP biocide cellulaire dans le DMSO, en veillant à ce que le substrat soit complètement dissous. Ajouter la solution mère de biocide cellulaire DNP au mélange d'essai pour obtenir une concentration finale de 0,1 milligramme par millilitre.

Veillez à ce que chaque plaque utilise environ 20 millilitres de solution et qu'une quantité supplémentaire de 50 millilitres soit nécessaire pour tenir compte du volume mort. Configurez le Q fill three comme précédemment pour distribuer le mélange d'essai sur chaque plaque à l'aide du Q fill three. Le remplissage de chaque plaque prend environ 20 secondes.

Une fois le mélange de dosage ajouté, incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Dans une boîte d'humidité, retirer les plaques de l'incubateur à 37 degrés Celsius. Mettre les couvercles de côté et placer les plaques sur la plateforme de chargement du magasin fournie avec le système rapid stack, de la même manière qu'auparavant.

Ouvrez le programme d'analyse et configurez-le comme précédemment, à l'exception de la mesure photométrique, qui doit être réglée sur une lecture à 400 nanomètres. Saisissez ensuite les paramètres dans le programme POLARA RS, comme cela a été démontré précédemment.

Laissez le Vario scan lire les plaques. Après l'analyse, retirez et éliminez les plaques. Pour exporter les mesures d'absorbance, ouvrez le logiciel de scan et sélectionnez.

Ouvrez un fichier existant. Sélectionnez le répertoire dans lequel la session a été enregistrée et cliquez sur l'icône plus pour développer la liste. Sous l'en-tête du titre, des options intitulées conteneur un à conteneur N seront disponibles. En fonction du nombre de plaques, sélectionnez la première plaque à analyser dans la barre de menu située en haut de la page, puis choisissez l'exportation du rapport de données.

Choisissez les options d'exportation, telles que la disposition de la plaque et les données photométriques. Cliquez sur afficher le rapport, puis sur enregistrer le fichier. Sélectionnez le répertoire souhaité.

Le format de sortie est une feuille de calcul Microsoft Excel. Ici, les mesures d'absorbance provenant d'une seule plaque de 384 puits contenant un clone positif, comme indiqué, montrent une augmentation marquée de l'absorbance par rapport aux clones n'exprimant pas d'activité cellulase.

Les différences de durée de dosage, de puits, d'emplacement sur la plaque ou de concentration en DNP peuvent influencer les valeurs absolues de l'absorbance. Les mesures relatives de l'absorbance, telles que l'écart d'absorbance par rapport à la moyenne de la plaque ou à la moyenne de la colonne, constituent une méthode plus robuste pour identifier les clones positifs à la cellulase. Nous venons de vous montrer comment identifier les clones positifs à la cellulase à partir d'une banque métagénomique.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de dissoudre votre DNP cell bio side dans du DMSO et d'incuber vos plaques dans une chambre humide. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.