ARN interférence dans les tiques

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la technique d'interférence par ARN chez les tiques par injection. Cette technique est réalisée en synthétisant d'abord un ARN double brin du gène ou des gènes d'intérêt. L'ARN est ensuite injecté dans les tiques, qui sont ensuite maintenues dans une chambre d'humidité pendant 24 heures.

Après cette période de maintien, on permet aux tiques de se nourrir sur un animal tel qu'un mouton. Des paramètres d'alimentation tels que le poids, la mue, la position des œufs, ainsi que l'expression du gène ou des gènes ciblés par RT-PCR en temps réel sont déterminés. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui démontrent l'effet de l'inactivation des gènes ciblés sur la biologie des tiques, évaluée par l'analyse des paramètres biologiques des tiques et de l'expression génique par RT-PCR en temps réel.

Notre équipe travaille sur les tiques afin de caractériser les événements moléculaires à l'interface tique-pathogène, et d'utiliser ces connaissances fondamentales pour développer des méthodes de contrôle de l'infestation par les tiques et de la transmission de pathogènes aux humains et aux animaux. L'interférence par ARN s'est imposée comme un outil essentiel dans cette recherche, car c'est la seule méthode disponible pour la manipulation génétique des tiques. La fonction de nombreux gènes de tiques est inconnue.

L'interférence par ARN permet de définir le rôle des gènes des tiques et de leur expression génique dans de nombreux aspects de la biologie des tiques, notamment l'accouplement, la reproduction, l'alimentation, la digestion, la fonction des glandes salivaires et la compétence vectorielle des tiques dans la transmission des agents pathogènes. La procédure sera démontrée par l'équipe d'interférence ARN sur les tiques de notre laboratoire, le Dr Ed Lewin, l'étudiant diplômant Busby et moi-même. Pour produire de l'ARN double brin, synthétisez d'abord des amorces oligonucléotidiques contenant des séquences promoteur T7 destinées à la transcription in vitro d'ARN.

Par exemple, le centre dermique varie la lesion. Utilisez les amorces oligonucléotidiques D huit A a T 75 et D huit DVT 73 indiquées ici. Amplifiez le gène cible par RT-PCR en utilisant 10 picomoles de chaque amorce oligonucléotidique et de 1 à 10 nanogrammes d'ARN total de tique.

Ensuite, purifiez le produit de PCR. Puis utilisez huit microlitres ou environ 100 nanogrammes pour synthétiser l'ARN double brin. Pour préparer les tiques en vue de l'injection, lavez d'abord les tiques dans la série de solutions suivante : eau du robinet, peroxyde d'hydrogène à 3 %, eau distillée deux fois, éthanol à 70 % et deux lavages finaux avec de l'eau distillée.

Effectuer chaque lavage dans un tube à centrifuger jetable de 50 millilitres en agitant, puis verser la solution à travers un tamis en fil métallique fin. Laisser sécher les tiques sur du papier absorbant, puis répartir les tiques en groupes de 20 à 50 selon l'expérience.

Placer chaque groupe dans un gobelet en plastique de 1,25 once avec un couvercle hermétique et étiqueter chaque gobelet avec le groupe expérimental. Ensuite, constituer une équipe d'ARNi composée de trois personnes qui effectueront le processus d'injection. La première personne positionne chaque tique sur un ruban adhésif double face fixé sur une feuille de cire dentaire rouge de trois sur six pouces.

La deuxième personne injecte les tiques, tandis que la troisième surveille les tiques après l'injection, souffle du dioxyde de carbone sur les tiques pour les activer, puis compte et transfère les tiques vivantes dans des gobelets étiquetés avec le numéro du groupe expérimental. Tous les membres de l'équipe doivent porter des gants jetables. Pour commencer le processus d'injection des tiques, attraper une tique à l’aide de pinces fines Dumont et la placer sur le dos, ventre vers le haut, sur un ruban adhésif double face fixé sur une feuille de cire dentaire rouge. Positionner les tiques en groupes de cinq. Placer une petite bande de ruban adhésif de masquage sur les pièces buccales des cinq tiques.

Afin de les immobiliser davantage, laissez la majeure partie du corps exposée afin que l'injecteur de tiques puisse observer le processus d'injection. Pour injecter la tique, percez un trou dans le quadrant inférieur droit de la surface ventrale de l'exosquelette à l'aide d'une seringue à insuline mono-éjecteur munie d'une aiguille de 29 gauge et demi-pouce. Ensuite, injectez immédiatement aux tiques de 0,2 à 0,5 microlitres de solution d'ARN double brin à l'aide d'une seringue Hamilton sur mesure et d'une aiguille de 33 gauge d'un pouce avec une pointe biseautée à 45 degrés ; insérez bien l'aiguille dans la cavité de la tique pour garantir le positionnement et la rétention de l'ARN double brin.

Bien qu'un liquide soit libéré après l'injection, un positionnement profond de l'aiguille pour l'injection garantit que suffisamment d'ARN double brin est déposé dans la cavité du tique pour induire un silençage génique. Il faut veiller à ne pas trop injecter. Injecter les tiques, ce qui entraînerait une perte d'hémolymphe et la mort de la tique. Immédiatement après l'injection des tiques, les prélever du ruban adhésif double face à l'aide de pinces fines et les placer dans un récipient en plastique de récupération.

Les tiques resteront brièvement inactives après l'injection, mais devraient rapidement commencer à se déplacer dans la boîte. Activez les tiques en soufflant du dioxyde de carbone sur elles. Une fois que les tiques se déplacent et sont actives, la plaie d'injection guérira rapidement et elles survivront très probablement.

Compter les tiques dans chaque groupe expérimental et placer chaque groupe dans un gobelet en plastique étiqueté avec un couvercle hermétique. Remplacer toute tique décédée dans le groupe en cours avant d'injecter le groupe expérimental suivant. Nettoyer la seringue Hamilton avant d'injecter le groupe expérimental suivant en remplissant puis en expulsant la seringue avec du peroxyde d'hydrogène à 3 % frais.

15 fois, suivies de 15 rinçages à l’eau stérile. Veillez à ne pas plier le piston de la seringue Hamilton, sinon le piston ne se déplacera pas régulièrement et ne répondra pas au toucher délicat requis pour l’injection chez la tique. Après l’injection, placez les tiques dans une chambre contenant un récipient rempli d’eau et de sulfate de potassium, ce qui maintient une humidité élevée et les conserve pendant un jour.

Placez ensuite des tiques individuelles dans des cellules d’alimentation collées sur un mouton et laissez-les se nourrir avec un nombre égal de tiques mâles ou femelles non injectées, selon le sexe qui n’a pas été injecté. Récupérez et retirez les tiques femelles de la cellule d’alimentation une fois leur repas terminé, soit après environ 10 jours, soit lorsque les femelles témoins sont tombées de l’hôte. Incubez chaque groupe de tiques dans une chambre humide jusqu’à l’achèvement de la ponte. Évaluez la ponte par groupe en pesant la masse d’œufs produite par l’ensemble des tiques d’un groupe afin d’évaluer le phénotype des tiques après l’alimentation.

Déterminez le nombre de tiques ayant survécu et calculez le poids des tiques ainsi que la position des ovules et la fécondité des œufs. Selon le gène ciblé et les objectifs de l'étude, d'autres analyses peuvent être réalisées afin de confirmer l'inhibition du gène par RT-PCR. Après l'alimentation, disséquez les glandes salivaires et les intestins de tiques individuelles provenant des groupes injectés avec le contrôle et l'ARN double brin, puis extrayez l'ARN total à partir des échantillons tissulaires individuels.

Analyser les transcrits du gène cible dans des tissus individuels par RT-PCR en temps réel et normaliser les niveaux d'ARN par rapport à l'ARN ribosomique 16S de la tique. À l'aide de la méthode gene norm, exécuter des courbes de dissociation à la fin de la réaction afin de s'assurer qu'un seul amplicon est formé et que les amplicons se dénaturent systématiquement dans le même intervalle de température pour chaque échantillon, puis comparer les valeurs de CT normalisées pour les niveaux d'ARNm entre les tiques injectées avec le contrôle et celles injectées avec de l'ARN double brin en utilisant le test t de Student.

Le protocole décrit ici a été utilisé dans notre laboratoire pour l'ARNi chez de nombreuses espèces de tiques exotiques différentes. La quantité d'ARN double brin injectée dans les tiques varie selon la taille de la tique. Les espèces de tiques plus grandes peuvent accueillir un volume plus important.

Les références sont disponibles dans la partie écrite accompagnant le protocole. Si le protocole est correctement suivi, moins de 5 % de mortalité devrait être observé après 24 heures suivant la procédure d'injection. Un phénotype typique après l'extinction génique chez les tiques est montré ici, où un ensemble de tiques a été injecté avec des mélanges d'ARN double brin utilisés pour cribler des antigènes protecteurs chez les tiques.

Dans les tiques examinées par microscopie optique, une dégénérescence cellulaire au niveau des tissus peut être observée. Les modifications phénotypiques peuvent également s'accompagner d'une perte de fonction. Par exemple, l'ARNi de SUBIN entraîne des mâles stériles incapables de s'accoupler avec succès avec les femelles après interférence par ARN et les tiques.

D'autres méthodes peuvent être utilisées pour déterminer l'impact de la silenciation génique sur l'expression des gènes et des protéines ainsi que sur la biologie des tiques, notamment la R-T-P-C-R en temps réel, la microscopie optique, électronique ou confocale. La génomique ou la protéomique. L'interférence par ARN peut également être réalisée dans des cultures cellulaires de tiques et fournit une méthode in vitro pour l'étude des interactions entre cellules de tiques et agents pathogènes.