Fermé protocole Culture Cell System utilisant des navires HyperStack avec la technologie des matériaux perméables au gaz

L'objectif général de cette procédure est de démontrer l'utilisation correcte en système fermé des vaisseaux empilés Corning Hypers. Cela est réalisé en premier lieu en inoculant les vaisseaux et en les remplissant de milieu par la méthode d'alimentation par gravité. Ensuite, la suspension cellulaire est isolée dans chacune des couches et les cellules sont incubées.

Après l'incubation, le milieu utilisé est éliminé. La dernière étape de la procédure consiste à récolter les cellules à partir des vaisseaux en empilement hypers. En fin de compte, les résultats de diffusion des gaz sont obtenus afin de démontrer la capacité des cellules à accéder à l'oxygène pendant leur croissance jusqu'à confluence lorsque le système fermé en empilement hypers est utilisé.

Le principal avantage du récipient Hypers Stack doté d'un matériau perméable aux gaz est qu'il offre une surface accrue pour la croissance cellulaire. En éliminant l'espace de tête dans le récipient, mon collègue p pardo va maintenant démontrer un protocole en système clos pour l'utilisation du récipient Hypers Stack. Le récipient Hypers Stack est composé d'un étage, qui est le compartiment individuel de culture cellulaire constitué de la plaque supérieure et du film perméable aux gaz.

Les cellules sont cultivées dans ce compartiment. Le collecteur liquide relie chacune des couches entre elles au sein d'un module. Les modules sont reliés par des tubes afin de former des vaisseaux constitués de multiples de 12 couches.

L'ensemble permet à l'utilisateur d'effectuer une seule manipulation des fluides sur l'ensemble du récipient. L'ensemble pneumatique relie également les couches stat entre elles, mais sert à déplacer l'air du récipient lors des ajouts de liquide et comporte une ligne de remplissage utilisée pendant le remplissage entre chaque couche. La couche stat est un espace ouvert à l'air appelé espace trachéal, permettant les échanges gazeux à travers la membrane perméable aux gaz de chaque couche.

Le tube de manipulation des liquides est relié au collecteur de liquide et constitue un composant personnalisable utilisé pour effectuer toutes les manipulations de fluides en système fermé afin d'éliminer l'excès d'air tout en maintenant la stérilité. Le tube de ventilation est utilisé. Le tube de ventilation est relié au collecteur d'air et contient un filtre à air.

Connecté au tube de manipulation des liquides, on trouve le tube de rinçage et le filtre, qui servent à évacuer le liquide du tube de manipulation après le remplissage du récipient. Également utilisé dans ce protocole, le manipulateur Corning Stack, ou CSM, est un dispositif de manipulation qui facilite le positionnement correct des récipients pendant leur utilisation. Dans cette démonstration, la culture cellulaire en système clos est illustrée pour un récipient perméable aux gaz comportant 36 couches.

À l'aide d'un CSM, toutefois, les détails pour effectuer cette procédure sur un récipient de 12 couches en utilisant un coin de remplissage sont disponibles dans le protocole écrit joint. Commencez par préparer 3,9 litres de milieu en sachet avant d'ensemencer le tube de milieu. Faites communiquer le sachet de sérum avec le sachet de milieu et mélangez soigneusement afin d'obtenir la concentration souhaitée de sérum.

Pincez environ 300 millilitres de milieu dans le sac à l’aide de pinces larges pour sac. Cela garantit que toutes les cellules inoculées seront utilisées lors du remplissage, et qu’aucune ne restera dans le sac de milieu. Placez le sac de milieu sur un support pour inoculer le milieu.

Remplissez une seringue reliée à un tube avec la suspension cellulaire. Fixez la seringue contenant la suspension cellulaire au sac de milieu par soudure de tube. Trois pouces et seize du tube de la seringue au sac.

Injectez la suspension cellulaire dans le sac de milieu et mélangez soigneusement. Le sac de milieu inoculé peut être raccordé au tube de transfert de liquide de trois huitièmes de pouce du récipient par soudage de tube ou à l’aide de raccords polyvalents. Aujourd’hui, nous utiliserons le soudage de tube.

Fermer les pinces sur les tubes de manipulation du liquide et de suivi du récipient. Placer le récipient à 36 couches dans un CSM en position de chargement. Raccorder le tube du filtre de ventilation à la pince de maintien sur le CSM.

Serrer le couvercle et déplacer le CSM en position de remplissage afin de placer le filtre à air en position la plus élevée pour éviter tout mouillage pendant l'opération de remplissage. L'angle de 10 degrés permet également l'équilibration du liquide entre les couches pendant le remplissage, en évacuant l'air de la ligne de remplissage. En positionnant le sac de milieu au même niveau que le récipient tout en maintenant la pince du tube de rinçage fermée.

Ouvrir la pince du tube de manipulation des liquides et la pince du sac de milieu pour permettre au fluide d'entrer dans le récipient. À l'aide du support pour sac, soulever le sac de milieu afin d'aider la suspension cellulaire à s'écouler dans le récipient. Remplir le récipient jusqu'à ce que tout le milieu inoculé soit entré dans le récipient.

La partie supérieure du sac de milieu doit encore contenir 300 millilitres de milieu. Retirer la pince du sac de milieu pour continuer à remplir le récipient lorsque le liquide atteint le collecteur d'air supérieur. Ralentir le débit de remplissage en abaissant le sac de milieu afin d'éviter un trop-plein.

Amenez lentement le niveau de liquide jusqu'à la ligne de remplissage et pincez le tube de manipulation du liquide. Placez le récipient dans le CSM en position d'isolement en mettant les deux jeux de collecteurs en position haute. Abaissez le sac de milieu en dessous de la hauteur du récipient.

Avec le filtre de transfert maintenu en position verticale, ouvrez la pince du tube de transfert. Cela permettra de faire revenir le milieu contenu dans le tube de manipulation des liquides vers le sac de milieu. Une fois le tube vide, fermez la pince sur le tube du sac de milieu.

Conserver le filtre du tube de récupération en position verticale. Ouvrir le collier sur le tube de transfert du liquide du récipient afin de permettre à tout liquide restant d'entrer et de s'équilibrer dans le récipient. Attendre une à deux minutes pour que cela se produise.

Ensuite, tournez le récipient dans le module de support clinostat (CSM) de manière à ce que les collecteurs se trouvent à gauche. Abaissez le récipient jusqu'à la position de chargement sur le CSM. Fermez les pinces sur les tubulures de transfert et de manipulation des liquides.

Le sac de milieu peut maintenant être retiré du récipient, ou il peut rester attaché pour une utilisation ultérieure lors de la procédure de récolte. Pour ranger le sac de milieu attaché, roulez-le et placez-le sous les bandes de maintien dans le plateau de rangement du récipient. Enfin, déplacez le récipient dans l’incubateur. Lorsque vous transportez le récipient, veillez à ce qu’aucun liquide n’entre dans le filtre du vent d’aération.

Cela s'effectue en inclinant légèrement l'extrémité du collecteur vers le haut. Pour commencer la procédure de récolte, soudez le tube, la solution d'association des cellules et les poches de trempe ensemble afin de former l'ensemble de poche de récolte, et assurez-vous que toutes les pinces de tubulure soient fermées. Retirez le récipient de l'incubateur et placez-le dans le SMC en position de chargement.

Détachez le sac de milieu des bandes de retenue et accrochez-le au sac. Ensuite, placez-vous debout, serrez le couvercle pour fixer le récipient. Accrochez le tube de ventilation dans la pince de maintien et déplacez le CSM en position de remplissage.

S'assurer que le sac de milieu sur le support est suspendu plus bas que le récipient. Ouvrir le collier de serrage sur le tube du sac de milieu et sur le tube de manipulation du liquide du récipient afin de permettre au milieu de s'écouler dans le sac raccordé. Une fois que le récipient est environ aux trois quarts vide, modifier les paramètres du CSM pour passer à la position finale vide.

Lorsque le récipient et le tube de transfert du liquide sont vides, soulevez le tube afin de faire avancer le milieu au-delà du pinçon sur le tube du sac de milieu usagé. Fermez ensuite le pinçon situé sur le tube de transfert du liquide et celui situé sur le tube du sac de milieu usagé. Remplacez le sac de milieu usagé par l'ensemble du sac de récolte par soudure de tubes.

Élevez la hauteur de l'ensemble du sac de dissociation cellulaire au-dessus de celle du récipient à l'aide du support pour sac. Placez le CSM en position de remplissage. Ouvrez la pince du tube de solution de dissociation cellulaire et la pince de l'ensemble du sac de récolte, puis transférez la solution dans le récipient.

Lorsque le transfert est terminé, fermez les pinces sur les tubulures de manipulation des liquides et sur celles de la solution de dissociation cellulaire. Ensuite, amenez le CSM en position de chargement tout en maintenant le levier de positionnement horizontal ouvert. Balancez doucement le récipient d’un côté à l’autre à l’aide de la roue, en répartissant la solution sur les couches cellulaires.

Le récipient peut parfois être ramené en position de remplissage pendant le basculement afin de maintenir une répartition uniforme de la solution. Une fois que la solution est correctement répartie, relâchez le levier du CSM pour verrouiller la position de remplissage. Laissez le récipient dans cette position pendant la durée de dissociation requise pour les cellules.

Utilisez la turbidité comme indicateur pour déterminer le détachement des cellules. Une fois détachées, déplacez le CSM en position de chargement. Ouvrez le collier du sac de trempage et le collier du tube de transfert de liquide pour permettre au milieu de trempe d'entrer dans le récipient.

Fermez le collier sur le tube de manipulation des liquides. Une fois le transfert terminé, remettez le CSM en position de chargement et maintenez le levier de positionnement horizontal pour balancer le récipient d’un côté à l’autre. À l’aide du support de poche, abaissez la poche de récolte en dessous du niveau du récipient.

Régler le CSM sur la position vide. Ouvrir la pince du tube de manipulation des liquides du récipient et transférer la solution cellulaire dans le sac de trempage. Ramener le CSM en position de chargement et déconnecter l'ensemble du sac de récolte du récipient à l'aide d'un scelleur de tube.

La solution cellulaire est désormais prête à être traitée dans des systèmes classiques de culture cellulaire. Avec Headspace, l'oxygène présent dans le milieu est appauvri en moyenne de 50 % sur une période de trois jours. En culture, ce graphique illustre la diminution, exprimée en milligrammes par litre, de la concentration en oxygène au niveau des cellules en fonction du temps dans le même système de culture ; le gradient d'oxygène sur une hauteur de milieu de trois millimètres est presque 50 % plus élevé au niveau de l'interface milieu-Headspace qu'au niveau de la couche cellulaire.

Le pourcentage d'oxygène dans l'espace trachéal de l'empilement hypers pendant la croissance cellulaire est indiqué. La figure montre qu'au cours de 96 heures, le pourcentage d'oxygène entre les couches, qui alimente chaque fond en film perméable aux gaz, reste constant. Cela démontre la capacité des cellules à accéder à l'oxygène pendant leur croissance jusqu'à la confluence.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment remplir et récolter le flacon Corning Hypers stack en système fermé.