Protocoles de sélection mutagenèse et fonctionnelles pour l'évolution dirigée de protéines dans les E. coli

L'objectif général de cette procédure est de créer une bibliothèque de mutants aléatoires pour une séquence d'ADN cible donnée, puis d'identifier et de caractériser rapidement les mutants à l'aide d'une sélection fonctionnelle semi-quantitative. Cette opération s'effectue tout d'abord en transformant un plasmide contenant la séquence cible et une origine de réplication dans une souche mutagène de coli. Après ensemencement et incubation des cellules pendant une nuit, celles-ci sont récoltées et le plasmide cible est isolé afin d'obtenir la bibliothèque de mutants. Cette bibliothèque de mutants est ensuite transformée dans une souche témoin afin de caractériser les mutations lors de la deuxième partie du protocole. Une boîte de Petri à gradient de croissance est préparée, et des cultures bactériennes de la souche témoin sont déposées dans une boîte de Petri distincte contenant du soft aer.

La dernière étape de la procédure consiste à transférer par estampage ces cultures bactériennes sur le gradient. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant des modifications du profil phénotypique d'une séquence cible donnée, grâce aux différences de croissance sur un gradient de médicament. Cette vidéo présente une méthode d'évolution dirigée de protéines chez E. coli.

Ce processus imite l'évolution naturelle lors de la génération de bibliothèques aléatoires de nutriments, suivie d'une sélection qui restreint cette diversité. Ainsi, il améliore notre capacité à générer de nouvelles activités biochimiques à des fins industrielles ou biomédicales. Cette procédure comporte deux composantes : la génération d'une bibliothèque de mutants aléatoires et la sélection fonctionnelle permettant d'obtenir des mutations à gain de fonction. La démonstration de cette procédure sera assurée par Jennifer Allen, technicienne de mon laboratoire.

Avant le début de ce protocole, préparer des cellules JS 200 électrocompétentes exprimant une variante à faible fidélité de la polymérase ADN I, ou polymérase I à faible fidélité, préalablement préparées comme décrit dans le protocole écrit. Ces cellules contiennent un allèle thermosensible de la polymérase I, de sorte que l'activité de la polymérase I à faible fidélité prédomine à 37 °C. Construire un plasmide cible contenant une origine de réplication coli I, avec la séquence cible clonée à proximité de l'origine de réplication. La polymérase I à faible fidélité initie la réplication du plasmide coli I, introduisant ainsi des mutations pour amorcer la mutagenèse.

Combiner 40 microlitres de cellules électro-compétentes et entre 30 et 250 nanogrammes d'ADN plasmidique cible dans un entrefer de deux millimètres. Réaliser l'électroporation en appliquant une impulsion dans l'électrode à 1800 volts. Vérifier la constante de temps ou TC afin de garantir des conditions d'électroporation uniformes pour chaque échantillon.

Idéalement, TC est égal à cinq à six millisecondes. Laisser le mélange d'ADN cellulaire se recouvrer dans un millilitre de bouillon LB pendant 40 minutes à 37 °C sous agitation à 250 tr/min. Préparer une boîte de Petri LV agro de 100 millimètres préchauffée à 37 degrés Celsius, contenant les antibiotiques appropriés pour sélectionner les deux plasmides, et ensemencer les cellules récupérées à une dilution adéquate afin d'obtenir une concentration proche d'une pelouse, définie comme un nombre distinct mais non dénombrable de colonies, tel qu'illustré dans cet exemple.

Après une incubation nocturne, récolter les colonies bactériennes des boîtes de Petri à l'aide de bouillon LB. Isoler le plasmide, l'ADN des cellules récoltées, le plasmide résultant. L'ADN constitue la bibliothèque de mutants aléatoires.

Réaliser une digestion par enzyme de restriction en coupant la banque de plasmides avec une enzyme de restriction qui linéarise à la fois le plasmide cible et le plasmide pôle. Réaliser une électrophorèse sur gel agarose analytique avec l'ADN plasmidique isolé afin de confirmer la qualité et la quantité. Une fois la vérification des plasmides effectuée, digérer un microgramme de la banque avec une enzyme de restriction qui linéarise le plasmide pôle, mais qui ne coupe pas le plasmide cible.

Une fois la digestion par enzymes de restriction terminée, purifiez la banque à l’aide d’un kit de purification de l’ADN. Enfin, transformez la banque purifiée dans une souche témoin afin de caractériser les mutations. Pour commencer la préparation du gradient, marquez 10 sillons espacés uniformément le long d’un bord du fond de la boîte de Pétri carrée.

Placer la boîte en position inclinée de sorte que le bord inférieur marqué soit surélevé de sept millimètres. Verser 25 millilitres d'agar LB tiède, bien mélangé à une concentration appropriée de l'agent de sélection, dans la boîte inclinée. Il s'agit de la couche inférieure du gradient.

Veillez à ce que l'agar LB recouvre la boîte de Pétri de manière à ce que l'extrémité surélevée et marquée de la boîte contienne environ un millimètre d'agar LB, et que la partie abaissée en contienne environ huit millimètres. Recouvrez la boîte avec le couvercle KU pour assurer la ventilation et laissez l'agar durcir pendant 10 à 15 minutes. Une fois que la couche inférieure d'agar LB est solidifiée, déplacez la boîte sur une surface plane.

Ensuite, verser 25 millilitres d'agar LB tiède sans agent de sélection pour recouvrir la première couche d'agar, en veillant à recouvrir entièrement la couche inférieure. Couvrir la boîte avec le couvercle KU pour assurer la ventilation, puis laisser l'agar durcir pendant 10 à 15 minutes afin d'effectuer le transfert par estampage des bactéries. Prélever d'abord des cultures bactériennes de la souche témoin et les diluer pour obtenir des densités cellulaires identiques, avec une densité optique à 600 nanomètres inférieure à 1,0.

Ensuite, transférez deux millilitres d'agar mou liquide équilibré à 42 degrés Celsius au fond d'une boîte de Petri ronde de 100 millimètres, pipetez 40 microlitres de la culture bactérienne dans l'agar mou, puis mélangez en balançant la boîte. Recouvrez le bord long de la lame de microscope en verre avec le mélange d'agar mou. Puis alignez le bord recouvert de la lame avec la marque inférieure sur la boîte à gradient.

Toucher la lame à la surface de l'agar. Un contact léger suffit pour transférer un ruban d'agar mou à la surface du gradient. La lame est ensuite mise de côté pour être nettoyée et réutilisée.

Répétez ce processus. Les échantillons restants ainsi que les contrôles expérimentaux doivent être inclus sur chaque boîte avec gradient. Si plusieurs gradients sont réalisés, incubez la boîte avec gradient à l’envers pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Les durées et températures d’incubation peuvent varier selon les souches bactériennes utilisées pour la détection, mais une incubation nocturne à 37 degrés Celsius est généralement suffisante pour observer une croissance visible.

Enfin, imagez et analysez la croissance cellulaire comme décrit dans le protocole écrit. Ci-dessous sont présentées des images d'une souche rapporteur transformée soit avec le P-G-F-U-V non muté, soit avec une bibliothèque mutante de PG FPUV, ayant été soumises à quatre cycles de mutagenèse. Les colonies sombres ou peu lumineuses indiquent la présence de plasmides contenant des mutations inactivant la GFP.

Cette figure représente la fréquence des mutations dans toute la séquence neutre du plasmide cible, par intervalles de 100 paires de bases. Remarquez que les mutations surviennent sur l'ensemble de la séquence du plasmide, mais avec une fréquence maximale près de l'origine de réplication. Ici, la croissance des mutants est illustrée en fonction d'un gradient de médicament.

La distance parcourue vers le haut du gradient indique un profil de résistance différentielle aux médicaments parmi les mutants. Dans cet exemple, des bibliothèques d'ADN circulaires du déméthylase oxydatif humain ABH deux ont été criblées afin d'identifier des mutants présentant une résistance accrue au méthyl méthanesulfonate, en utilisant des gradients de sélection médicamenteuse.Deux. Ces bibliothèques, représentant deux et quatre itérations du protocole de mutagenèse, sont présentées en comparaison avec le type sauvage parental et le vecteur vide.

La ligne blanche indique le seuil au-dessus duquel des colonies mutantes individuelles ont été isolées. Pour une analyse phénotypique supplémentaire, les mutants de la bêta-lactamase, R 1 64 H et E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, précédemment identifiés à l’aide d’une mutagenèse P un à faible fidélité et d’une sélection astri et m, sont représentés sur un gradient de céfotaxime de 0,4 microgramme par millilitre et de quatre microgrammes par millilitre. La protection contre le céfotaxime indique une activité de bêta-lactamase à large spectre.

Remarquez que l'enzyme bêta-lactamase de type sauvage ne confère aucune protection par rapport aux cellules exprimant un vecteur vide. Par conséquent, ces mutants représentent une adaptation ou l'évolution d'une nouvelle activité biochimique. Nous avons ici présenté une combinaison puissante de mutagenèse et de sélection fonctionnelle pour la génération de nouvelles activités biochimiques.

Une sélection fonctionnelle peut être obtenue soit par sélection à l'aide d'un médicament, soit par complémentation génétique, et elle exploite notre capacité à générer une grande diversité génétique. La pathogenèse pourrait devoir être restreinte à une séquence donnée afin d'optimiser les activités protéiques préexistantes ou pour une pathogenèse dirigée vers un site spécifique. Cela peut être facilement réalisé par clonage.

En outre, la mutagenèse peut être dissociée d'une sélection fonctionnelle afin d'obtenir des attaques caractéristiques ou des empreintes mutationnelles.