La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de

L'objectif de cette procédure est d'étudier les relations fonctionnelles entre les gènes et les voies bactériennes. Cela est réalisé en premier lieu par la préparation d'une série de souches uniques de mutants d'Escherichia coli, qui seront ensuite soumises à une conjugaison ou un croisement. La deuxième étape consiste à effectuer la conjugaison des mutants uniques selon un format matriciel sur des boîtes de culture.

Ensuite, les doubles mutants sont sélectionnés. La dernière étape consiste à imager les boîtes des doubles mutants et à quantifier les colonies de doubles mutants afin de déterminer la capacité adaptative des souches. En définitive, les données de taille des colonies sont analysées pour calculer les scores d'interaction génétique et identifier les gènes, voies et processus fonctionnellement interagissant.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la mutagenèse aléatoire réside dans la possibilité de créer de nombreuses souches doubles mutantes individuelles. De plus, les interactions entre de nombreux gènes peuvent être évaluées simultanément, indépendamment de la taille du gène, de son caractère essentiel ou de la capacité d'adaptation du mutant simple. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des systèmes, notamment celles relatives aux fonctions des gènes et aux interactions fonctionnelles entre voies et processus.

Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des infections bactériennes, car la connaissance des gènes et processus fonctionnellement les plus centraux, ainsi que la compréhension des combinaisons de gènes, voies et processus bactériens dont la perturbation améliore ou réduit l'aptitude bactérienne, permettront d'élaborer les stratégies d'intervention les plus efficaces. Pour commencer ce protocole, une amplification PCR imbriquée en deux étapes est utilisée afin de remplacer le cadre de lecture ouvert cible par un marqueur de résistance au chloramphénicol provenant du plasmide PKD3, comme décrit dans la procédure écrite.

Confirmez le produit attendu et purifiez le fragment obtenu par PCR en suivant le protocole du fabricant. Après élution du produit de PCR dans 30 microlitres d'eau distillée stérile, diluez-le à une concentration d'environ 50 milligrammes par microlitre. Le produit purifié est conservé à moins 20 degrés Celsius avant la transformation.

Ensuite, préparez les cellules compétentes à forte fréquence de recombinaison ou HFR Caval pour la construction du donneur. Inoculez d'abord un millilitre d'une culture saturée de la souche HFR Cavalli, incubée toute la nuit, dans 70 millilitres de milieu LB frais contenant 35 microlitres d'ampicilline à 50 milligrammes par millilitre, dans un flacon de 250 millilitres.

Incuber la culture à 32 degrés Celsius en agitant doucement à 220 tr/min jusqu'à obtention d'une densité optique comprise entre 0,5 et 0,6. Ensuite, transférer la culture dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pour l'induction thermique du système de recombinaison Lambda Red pendant 15 minutes avec agitation à 160 tr/min afin d'arrêter l'induction. Transférer ensuite la culture dans un bain glacé à base de glace pilée pendant 10 à 20 minutes à 160 tr/min.

Veillez à maintenir les cellules au froid jusqu'après la transformation. Après avoir lavé et récolté les cellules par centrifugation comme décrit dans le protocole écrit, décantez le surnageant et resuspendez le culot dans 500 microlitres d'Eloqua glacé contenant 10 % de glycérol. Répartissez les cellules en volumes de 50 microlitres dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre prérefroidis et procédez immédiatement à la transformation.

Ajoutez 100 nanogrammes de cassette de délétion génique purifiée aux cellules compétentes. Agitez doucement le tube et laissez la suspension reposer sur de la glace pendant cinq minutes. Transférez ensuite la suspension dans une cuvette d'électroporation prérefroidie et effectuez immédiatement l'électroporation du mélange cellulaire.

Ajouter un millilitre de milieu SOC à température ambiante et transférer les cellules électroporées en milieu dans un tube de culture de 15 millilitres. Incuber les cellules à 32 degrés Celsius pendant une heure avec agitation orbitale à 220 tr/min. Après l'incubation, centrifuger les cellules à 4 400 ×g pendant cinq minutes.

À température ambiante, retirez environ 850 microlitres du surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans le liquide restant. Étalez les cellules sur des géloses LB contenant 17 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et incubez à 32 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, effectuez des striations de deux transformants individuels sur des géloses LB au chloramphénicol pour confirmer le mutant, et effectuez également des striations des mêmes transformants sur des géloses LB à la canamycine afin de confirmer que les souches ne sont pas résistantes à la canamycine.

Ensuite, l'ADN est amplifié à l'aide de trois jeux différents d'amorces de confirmation de disruption génique, comme décrit dans le protocole écrit. Le premier jeu d'amorces comprend une amorce directe de 20 nucléotides située en amont de 200 paires de bases par rapport à la région ciblée, et une amorce inverse, complémentaire du cassette de résistance au chloramphénicol. Cette amplification devrait produire un amplicon de 445 nucléotides.

Le deuxième jeu comprend un amorçage direct, un amorçage dirigé vers la séquence du cassette de résistance au chloramphénicol, et un amorçage de confirmation en aval, conçu pour cibler une région située à 200 paires de bases en aval de l'extrémité 3' du gène supprimé. Cette réaction d'amplification devrait produire un amplicon de 309 nucléotides. La troisième PCR contient les deux amorçages flanquants, en amont et en aval.

Cette réaction est nécessaire pour confirmer que la souche sélectionnée n'est pas un diploïde médullaire dans lequel un locus génique aurait été remplacé par la cassette et un autre locus dupliqué, mais où une copie du gène sauvage reste encore présente. Cette amplification devrait produire un produit de 1,4 kb. La collection de mutants d'« E. coli Keio » avec délétion simple de gènes non essentiels est répliquée par robotique en points sur des plaques 24 ou 384.

Plaque de microtitration contenant 80 microlitres de milieu LB liquide par puits. Supplémenté avec 50 microgrammes par millilitre de canamycine afin de sélectionner la souche de contrôle de bordure, qui sert de témoin positif et facilite la normalisation des plaques ainsi que la quantification automatisée des colonies. Retirer le milieu inoculé des puits les plus externes de chaque plaque et le transférer vers de nouvelles plaques, en laissant les puits les plus externes vides.

De la même manière, créez des points de contrôle négatif en retirant deux souches de différents emplacements sur chaque plaque, puis en transférant ces souches sur une nouvelle plaque. Ensuite, comblez les puits vides, y compris les puits de contrôle périphériques et les puits de contrôle négatif, avec du milieu LV contenant 17 microgrammes par millilitre de chloramphénicol. Ces points de contrôle négatif doivent rester vides chez le récipient et donc sur les plaques double mutantes.

Ils permettent de s'assurer qu'aucune erreur de traitement ou de manipulation des plaques ne s'est produite lors de la numérotation ou du transfert sur les plaques. Après avoir préparé la souche témoin positive du bord comme décrit dans le protocole écrit, les souches du réseau ainsi que la souche témoin positive du bord sont cultivées toute la nuit à 32 degrés Celsius avec un agitage orbital à 190 tr/min ; le jour suivant, remplir les puits périphériques avec environ 80 microlitres de la culture de nuit. Les plaques ainsi préparées peuvent être utilisées pour le croisement, comme décrit dans la section suivante.

Alternativement, pour un stockage à long terme, chaque puits des plaques réceptrices est complété avec 15 % de glycérol et le milieu ainsi que le glycérol sont mélangés. Les plaques sont ensuite stockées à moins 80 degrés Celsius. Commencer la procédure d'accouplement en cultivant la souche donneuse HFR, portant la délétion du gène d'intérêt marquée par une cassette de résistance au chloramphénicol, pendant la nuit à 32 degrés Celsius dans un milieu liquide LB riche contenant 17 microgrammes par millilitre de chloramphénicol.

La collection ordonnée de mutants receveurs TH a été étalée à une densité de 3 colonies par plaque de 84 sur des plaques solides de milieu LB, supplémenté avec 50 microgrammes par millilitre de canamycine. En parallèle, le mutant donneur de la souche interrogée a été étalé à une densité de 3 colonies par plaque de 84 sur le même nombre de plaques LB.

Supplémenté avec 17 microgrammes par millilitre de chloramphénicol. Incuber les plaques toute la nuit à 32 degrés Celsius pour conjuguer les souches. Piquer le donneur à partir des plaques donneur de 84 colonies incubées toute la nuit sur des plaques LB solides.

Ensuite, piquer les souches à partir d'une seule plaque réceptrice de 84 colonies incubée toute une nuit sur les donneurs fraîchement piqués. Incuber les plaques de conjugaison piquées à 32 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. Ensuite, piquer chaque plaque de conjugaison en densité 384 sur une seule plaque solide de LB contenant du chloramphénicol.

Et peut-on répéter ce processus avec la mycine jusqu'à ce que toutes les plaques de conjugaison aient été transférées ? Incuber les plaques de première sélection récemment transférées pendant 16 à 36 heures à 32 degrés Celsius. Après l'incubation, retransférer chaque plaque de première sélection sur une plaque de double sélection médicamenteuse secondaire au format 1536 SPOT, de sorte que chaque colonie de première sélection soit représentée par quatre colonies.

Sur la deuxième plaque de sélection, incuber les plaques de 16 à 36 heures. À 32 degrés, photographier les plaques de sélection doubles mutantes finales afin de mesurer quantitativement la capacité de croissance des mutants et d'analyser les interactions entre les paires de gènes. Puisque les gènes appartenant au même chemin métabolique présentent des profils de GI étroitement corrélés, les gènes fonctionnellement associés peuvent être regroupés par regroupement selon la similarité globale de leurs profils de scores S.

La similarité des profils d'interaction génétique représente la concordance des phénotypes suite à la mutation de deux gènes et devrait indiquer si ces deux gènes agissent dans une même voie ou dans des voies chevauchantes. On observe ici la distribution des coefficients de corrélation entre les profils d'interaction génétique de paires de gènes codant pour des protéines interagissant physiquement, par rapport à des paires de gènes choisies aléatoirement. Un exemple de nuage de points illustrant la corrélation entre les profils génétiques de deux transporteurs formant un complexe hétérotrimérique nécessaire à l'excrétion des spermatozoïdes est présenté, de même qu'un gène d'e.coli chez la levure.

Les interactions atténuantes avec des profils d'interactions génétiques (GI) fortement corrélés ont tendance à coder des voies qui sont physiquement associées ou qui agissent de manière coordonnée dans une même voie biochimique. Voici un exemple représentatif où les composants des voies de biosynthèse du fer-soufre ISC et SUF, fonctionnellement redondantes et participant conjointement à un processus essentiel, forment des groupes distincts reliés entre eux par d'importantes interactions aggravantes. Une mesure statistique peut être utilisée pour détecter un enrichissement significatif d'interactions entre des combinaisons spécifiques de voies, ainsi que pour intégrer les réseaux d'interactions génétiques avec des interactions physiques et d'autres données d'association fonctionnelle, telles que le contexte génomique.

Les relations peuvent révéler l'organisation de modules fonctionnels d'ordre supérieur qui définissent les systèmes biologiques fondamentaux chez les bactéries. L'analyse de regroupement peut également être appliquée aux réseaux d'interactions génétiques pour prédire les fonctions des gènes annotés. Étant donné que les algorithmes de regroupement varient.

Cependant, les attributions fonctionnelles présumées déterminées par regroupement nécessitent une vérification expérimentale indépendante. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se rappeler d'inclure tous les contrôles positifs et négatifs nécessaires. D'autres méthodes, telles que la protéomique, les expériences de suivi biochimiques et la génomique chimique, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les fonctions spécifiques des gènes ainsi que la nature des relations fonctionnelles entre les gènes et les voies métaboliques.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment construire des souches doubles mutantes, assembler des réseaux de récepteurs et réaliser des cribles ESGA afin d'étudier les relations fonctionnelles entre les gènes et les processus chez E. coli.