Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

L'objectif général de cette procédure est de déterminer le tropisme viral chez un patient infecté par le VIH en séquençant la région V3 du gène de l'enveloppe virale afin de commencer par extraire l'ARN du VIH à partir du plasma sanguin du patient. Ensuite, amplifier la région V3 de la GP120 du VIH à l'aide d'une RT-PCR imbriquée. Puis détecter la présence du produit par électrophorèse sur gel, suivie d'un séquençage fondé sur la population des produits V3 amplifiés.

Enfin, analyser les séquences à l'aide d'un logiciel d'appel de bases et déduire l'utilisation du co-récepteur en utilisant l'algorithme de prédiction du génotype vers le phénotype. En définitive, ces résultats permettent de déterminer si la souche virale d'un patient est R5 ou non-R5 par séquençage populationnel de la boucle V3 du VIH. Ainsi, l'avantage principal de ce test de souche par rapport aux méthodes existantes, telles que les tests phénotypiques cellulaires, réside dans sa possibilité d'être réalisé dans tout laboratoire disposant d'un équipement de séquençage, à moindre coût, en moins de temps et avec une quantité réduite de matériel initial.

Cette technique est pertinente pour le traitement par thérapie antirétrovirale, car elle permet de déterminer si la population virale d'un patient est susceptible de répondre à un antagoniste du CCR5. À partir de 500 microlitres de plasma, utilisez un extracteur automatisé Easy Mag pour extraire l'ARN du VIH. Passez ensuite dans une salle propre pour PCR afin de préparer la RT-PCR, afin de garantir un échantillonnage adéquat de la population virale.

Prévoir d'effectuer chaque réaction de transcription inverse en triple exemplaire dans cette réaction en une étape. Utiliser l'ARN viral pour synthétiser l'ADNc, en amplifiant spécifiquement la région HIVV trois avec les amorces SQV trois F1 et CO 6 0 2 prime repair. Selon les composants par réaction.

Préparez une solution mère suffisante pour le nombre d'échantillons à amplifier en utilisant une pipette répétitive. Ajoutez 36 microlitres de mélange d'échantillon dans chaque puits de la plaque PCR. Passez ensuite à une pipette multicanal pour transférer des microlitres d'extrait d'ARN dans chacun des puits désignés. Veillez à changer les embouts entre chaque ajout.

Une fois le transfert terminé, couvrez les puits avec des capuchons de bande pour PCR. Ensuite, placez la plaque PCR dans un thermocycleur programmé pour une PCR en une étape avec transcription inverse de la région trois de HIVV. Pour la PCR imbriquée, utilisez la réparation des amorces SQV trois F deux et CD quatre R.

Calculez la quantité de réactif nécessaire au nombre d'échantillons à amplifier dans une salle propre pour PCR. Préparez le mélange de PCR imbriquée, puis utilisez une pipette répétitive pour aliquoter 19 microlitres par puits d'une plaque PCR propre. À l'issue de la R-T-P-C-R, déplacez-vous vers une salle post-amplification.

Utilisez une pipette multipipette à huit canaux pour transférer un microlitre du modèle d'RT-PCR dans le mélange de PCR nichée. Changez les embouts entre chaque ajout. Couvrez les puits avec des capuchons de bande PCR et transférez la plaque dans un thermocycleur pour l'amplification.

Retirer la plaque du thermocycleur une fois que la température est revenue à 25 degrés Celsius. Afin de confirmer que la région V trois a été correctement amplifiée, analyser d'abord les produits par électrophorèse sur gel. Préparer un gel d'AROS à 1,6 % avec un colorant pour gel de type cyber safe.

À l’aide d’une pipette multipuits de 10 microlitres, transférez huit microlitres d’échantillons PCR dans les puits respectifs. Chargez également une échelle d’ADN dans au moins un puit par ligne.

Faites migrer le gel à environ 100 volts pendant 10 minutes. Visualisez les bandes par fluorescence ultraviolette et documentez l'image par photographie. Notez les échantillons pour lesquels toutes les amplifications en triple ont été réussies.

Si nécessaire, répétez la RT-PCR pour les échantillons présentant moins de trois amplifications du produit. Les échantillons d'ADNc viral amplifiés sont ensuite vérifiés par des réactions de séquençage de l'ADN qui seront réalisées à l'aide des amorces V 3 0 2 F et S QV trois R un. Retirez le grand réactif du congélateur et laissez-le décongeler à température ambiante.

Calculez et préparez les réactifs nécessaires au nombre d'échantillons à analyser. Répartissez cinq microlitres de mélange de réaction de séquençage dans les puits appropriés de la plaque à l’aide d’une pipette multicanal. Recouvrez la plaque avec un essuie-tout Kim et mettez-la de côté.

Entre-temps, préparez une dilution au 1/15 du produit PCR amplifié en ajoutant 180 microlitres d'eau stérile au produit PCR restant. Pipetez un microlitre de l'échantillon dilué au fond du puits approprié. Changez toujours d'embout entre les échantillons dès que le transfert de l'échantillon est terminé.

Scellez la plaque avec des capuchons en bande et vortexez pendant une seconde. Pour centrifuger la plaque, réglez la vitesse à 140 5G. Lorsque la vitesse de rotation atteint 140 5G, arrêtez la rotation.

Placer la plaque dans un thermocycleur pour permettre la réaction. Dans chaque puits, précipiter l'ADN avec quatre microlitres d'acétate de sodium trois molaire et 40 microlitres d'éthanol glacé à 95 %, puis refermer les bouchons. Vortexer la plaque pendant 10 secondes et taper doucement sur la plaque pour déloger les bulles d'air éventuelles.

Placer les plaques à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes à deux heures. Récupérer l'ADN par centrifugation à 2000 ×g pendant 20 minutes. Retirer et jeter les bouchons en bande.

Retournez la plaque au-dessus du récipient de déchets et versez le surnageant. Éliminez tout surnageant résiduel en tamponnant les plaques retournées sur une serviette en papier.

Pliez deux feuilles de papier essuie-tout pour glisser la plaque entre elles. Placez la plaque face contre le fond de la centrifugeuse et centrifugez à 140 5G. Arrêtez la centrifugation dès que 140 5G est atteint.

Ensuite, laver avec 155 microlitres d'éthanol à 95 % et décantation. Répéter ensuite la centrifugation. Laisser reposer la plaque de deux à cinq minutes pour permettre à tout éthanol résiduel de s'évaporer.

Afin de dénaturer les échantillons d'ADN, utilisez une pipette multicanal pour distribuer 10 microlitres de colorant concentré pour maide dans tous les puits de la plaque, y compris ceux qui sont vides. Scellez la plaque avec une septima et placez-la dans un thermocycleur à 90 degrés Celsius pendant deux minutes. Enfin, placez la plaque d'échantillons dans une plaque de séquençage et insérez-la dans le séquenceur.

Un mode acceptable d’analyse des données consiste à utiliser le logiciel Recall afin d’effectuer un appel de bases automatique sans intervention humaine. Recall est un logiciel gratuit d’appel de bases personnalisé : connectez-vous et sélectionnez les fichiers d’échantillons à télécharger à l’aide de l’option de navigation. Localisez le fichier de données de séquençage brut et téléversez jusqu’à 20 mégaoctets.

Ensuite, définissez la séquence de référence sur V trois. Cliquez sur traiter les données. Sélectionnez le dossier résultant du côté droit de la page pour afficher la liste des échantillons.

Ceux qui sont rouges ont échoué. Ceux qui sont verts ont réussi. En cliquant sur un échantillon spécifique et sur le bouton de visualisation, vous pouvez examiner la séquence, suivre les instructions situées sur le côté droit de la page pour naviguer dans la séquence, et télécharger les fichiers dans un dossier compressé au format zip.

Le tropisme viral peut être déduit à partir de séquences générées par séquençage basé sur une population, en utilisant l'algorithme de prédiction du phénotype à partir du génotype pour le co-récepteur. Dans le menu déroulant des paramètres significatifs, sélectionnez l'option optimisée, basée sur l'analyse de données cliniques provenant de motivate à 2 % et 5,75 % de FPR. Choisissez maintenant de téléverser ou de coller une séquence pour analyse.

Les fichiers FASTA sont acceptables. Ne pas ajouter d'autres étapes pour obtenir un prédicteur génétique Tono FPRA de la réponse aux antagonistes du CCR cinq. Le rapport G deux P généré fournit la séquence de la boucle V trois en acides aminés et indique les positions pertinentes des mutations associées aux virus non R cinq.

En bas du rapport, le taux de faux positifs est indiqué et interprété en termes de réponse à un antagoniste du CCR5. Ce rapport peut être téléchargé sous forme de fichier PDF. Si l'une des trois séquences d'un échantillon est jugée non R5, le patient ne devrait probablement pas répondre à un antagoniste du CCR5. L'électrophorèse sur gel des amplifications RTP CR de la boucle V3 du VIH-1 indique que tous les échantillons cliniques ne produisent pas un produit.

Les séquences générées à partir des échantillons amplifiés peuvent être visualisées dans un chromatogramme lu par rappel. On s'attend à une séquence propre, avec peu de mélanges. Parfois, les séquences peuvent être désordonnées et ne pas permettre une attribution précise des bases.

Certains patients peuvent être identifiés comme ayant un virus n'utilisant pas CCR5, comme indiqué ici. Ces patients ne devraient probablement pas répondre au traitement par un antagoniste de CCR5. Toutefois, la majorité des patients présentent une population virale composée de virus utilisant CCR5, comme l'indique la case verte au bas du rapport d'analyse G2P.

Ainsi, une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre jours du début à la fin, c'est-à-dire de l'extraction à l'analyse. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de prédire le tropisme viral à l'aide de méthodes de séquençage fondées sur des populations, combinées à l'algorithme bioinformatique genome pheno.

Très bien, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.