Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la

L'objectif général de cette procédure est d'insérer des gènes gag provenant de personnes infectées par le VIH-1 sous-type C dans un plasmide de VIH-1 doté d'une capacité de réplication, afin d'évaluer l'effet des polymorphismes de la séquence gag sur la capacité de réplication du VIH-1 in vitro. Cette approche consiste d'abord à amplifier le gène gag à partir du plasma du patient. La deuxième étape consiste à cloner la séquence gag provenant du patient dans le clone moléculaire infectieux et réplicatif MJ-quatre. Ensuite, le plasmide chimérique gag-MJ-quatre est transfecté afin de produire des stocks viraux infectieux, puis titrés pour évaluer l'infectiosité sur une lignée cellulaire indicatrice. La dernière étape consiste à mesurer la capacité de réplication in vitro dans la lignée cellulaire T GXR-25. En définitive, un dosage de la transcriptase inverse marquée au radio-isotope est utilisé pour quantifier la production de virions au fil du temps et visualiser la cinétique de réplication virale.

La méthode que nous allons décrire aujourd'hui peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du VIH. Celles-ci incluent la définition des déterminants de la capacité de réplication du VIH et la compréhension de la manière dont la capacité de réplication du VIH affecte la pathogenèse à long terme. La description des méthodes aujourd'hui sera assurée par Jessica Prince et Dan Claiborne, deux de mes étudiants diplômants.

Pour commencer cette procédure, effectuez une transcription inverse de l'ADNc à partir de l'ARN et amplifiez les produits d'ADN du premier cycle à l'aide d'une transcriptase inverse et d'une ADN polymérase thermostable dans une réaction RT-PCR en une étape. Ensuite, en utilisant un microlitre de l'amplification PCR du premier cycle comme matrice d'ADN, réalisez une amplification PCR du second cycle en configuration imbriquée. Ajoutez ensuite trois microlitres de colorant de charge 5X à cinq microlitres du volume de réaction du second cycle.

Faites-le migrer à 120 volts sur un gel d’agarose TAE à 1 % contenant un colorant d’ADN fluorescent UV jusqu’à ce que les bandes soient résolues. Ensuite, visualisez les bandes de 1,6 kb sur un éclairage à lumière bleue. Après cela, faites migrer le volume restant de 45 microlitres de réaction sur un gel d’agarose TAE à 1 % contenant le colorant d’ADN. Découpez les bandes appropriées à l’aide d’une lame de rasoir propre et combinez trois réactions positives par individu. Ensuite, extrayez l’ADN à partir du fragment de gel à l’aide d’un kit de purification de gel et éluésez-le dans de l’eau sans nucléase. Congelez le produit à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. 0:15:56 Dans cette procédure, après amplification de la région UTR 5’ de la répétition terminale longue du plasmide MJ-quatre, visualisez les produits PCR de 1,3 kb sur l’éclairage. Découpez les amplicons positifs, puis purifiez-les et congelez-les comme décrit précédemment. Ensuite, créez les amplicons fusionnés MJ-quatre LTR gag par PCR d’extension par recouvrement par épissage. Visualisez, découpez, purifiez et congelez l’amplicon long de 3,2 kb. Digestez maintenant 1,5 microgramme de plasmide MJ-quatre et 1,5 microgramme de produit PCR LTR-gag purifié avec l’endonucléase de restriction BCL-un pendant 1,5 heure à 50 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez un microlitre de NGOM-quatre à la réaction de digestion et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après cela, ajoutez du colorant de charge 5x aux réactions de digestion par restriction. Faites migrer lentement le volume total sur un gel d’agarose TAE à 1 % contenant un colorant d’ADN pendant une à deux heures à 100 volts. Visualisez, découpez et purifiez les bandes indiquées pour le clonage comme décrit précédemment.

Ensuite, préparez les réactions de ligation en utilisant l'insert purifié LTR-gag et de l'ADN vectoriel MJ-four dans un rapport insert/vecteur de trois pour un. Incubez les réactions de ligation toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Ensuite, transformer des bactéries chimiquement compétentes JM-109 avec les produits de ligation étalés sur des boîtes de gélose LB contenant 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline. Faire croître les bactéries transformées à 30 degrés Celsius pendant au moins 22 heures. Pour confirmer la fidélité du clonage, couper l'ADN de mini-prep avec les enzymes de restriction NGOM-quatre et HPA-un lors d'une double digestion à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Ensuite, analyser sur un gel d'agarose TAE à 1 %. Calculer le volume de virus nécessaire à partir de chaque stock en fonction du titre en UI par microlitre obtenu lors d'un dosage sur cellules TZM-BL afin d'infester cinq fois 10 puissance 5 cellules GXR-25 à une multiplicité d'infection de 0,05. Veiller à porter les équipements de protection individuelle adéquats pour manipuler le VIH réplicatif, incluant une blouse intégrale, un masque facial et des gants doubles. Le jour de l'infection, sortir les stocks de virus du congélateur à moins 80 degrés Celsius et les décongeler. Ensuite, diluer le virus dans du milieu C-R-P-M-I jusqu'à un volume de 100 microlitres afin d'obtenir une MOI de 0,05. Ajouter au plateau 96 puits en fond v, traité pour culture cellulaire, en incluant à chaque série d'expériences de réplication un contrôle positif et un contrôle négatif, et organiser le plateau de sorte que chaque colonne sur deux reste vide afin de limiter la contamination croisée entre les puits. Ensuite, compter les cellules GXR-25 à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé et calculer le nombre total de cellules requis pour toutes les infections. Répartir le volume nécessaire dans un tube conique de 50 millilitres et centrifuger pour former un culot cellulaire. Puis aspirer soigneusement le milieu et resuspendre dans du C-R-P-M-I à une concentration de cinq fois 10 puissance 5 cellules par 100 microlitres. Prélever les cellules à la pipette et les verser dans un réservoir stérile, puis bien mélanger. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 100 microlitres de cellules dans chaque puits du plateau 96 puits contenant le virus dilué et bien mélanger. Ajouter ensuite deux microlitres de solution de polybrene à cinq milligrammes par millilitre dans chaque puits et bien mélanger les cellules. Incuber ensuite à 37 degrés Celsius dans une étuve à culture cellulaire avec 5 % de CO2 pendant trois heures.

Afin de laver les cellules infectées, centrifuger la plaque V en 96 puits afin de former un culot cellulaire. Ensuite, retirer soigneusement 150 microlitres du milieu et le remplacer par 150 microlitres frais de C-R-P-M-I sans perturber le culot cellulaire. Répéter la procédure deux fois supplémentaires afin de bien laver les cellules ; après la dernière centrifugation et l'ajout de 150 microlitres de C-R-P-M-I, resuspendre le culot cellulaire à l’aide d’une pipette multicanal. Ajouter le mélange de chaque puits à 800 microlitres de C-R-P-M-I dans un puits d’une plaque de culture tissulaire en 24 puits. Puis placer la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 5 % de CO₂ à 37 degrés Celsius. Tous les deux jours, transférer 100 microlitres de surnageant prélevé à la surface du puits de culture vers un puits d’une plaque en 96 puits en U, puis congeler pour une analyse ultérieure par le test RT. Ensuite, resuspendre soigneusement les cellules et retirer la moitié du volume restant afin d’éviter une surcroissance cellulaire. Puis, rétablir le volume initial en ajoutant 550 microlitres de C-R-P-M-I frais à chaque puits.

Dans cette procédure, ajouter un à deux microlitres de DTTP à 10 millicuries par millilitre et quatre microlitres de DTT à un molaire à chaque aliquot de un millilitre du mélange maître de RT. Mélanger soigneusement chaque tube de micro-centrifugation de 1,5 millilitre contenant le mélange maître de RT, le DTT et le DTTP à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres et transférer dans une cuve stérile.

Ensuite, distribuez 25 microlitres du mélange RT marqué dans chaque puits d'une plaque PCR à 96 puits à parois minces. Ajoutez 5 microlitres de chaque surnageant dans la plaque PCR contenant le mélange maître de RT. Scellez ensuite la plaque PCR avec un couvercle en feuille adhésive et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans un thermocycleur. Après l'incubation, faites de petits trous dans le couvercle en feuille à l’aide d’une pipette multicanal de 200 microlitres. Mélangez les échantillons cinq fois. Transférez 5 microlitres de chaque échantillon sur du papier DE-81 et laissez sécher à l’air pendant 10 minutes. Placez les taches dans des récipients de lavage séparés. Lavez ensuite les taches cinq fois avec du SSC 1X. Puis deux fois avec de l’éthanol à 90 % pendant cinq minutes par lavage, avant de les laisser sécher à l’air. Une fois sèches, enveloppez soigneusement la tache dans du film plastique et exposez-la à l’écran phosphorescent dans une cassette hermétiquement fermée toute la nuit à température ambiante.

Une fois prêt, analyser les écrans phosphorescents à l’aide d’un imageur à phosphor et quantifier les transcrits radioactifs.

Illustrées ici sont les images représentatives de gel illustrant la séparation électrophorétique des différents amplicons PCR nécessaires pour générer un amplicon gag dérivé du patient, pouvant être cloné dans le vecteur plasmidique MJ-quatre. Cette image représentative de gel montre la séparation électrophorétique des digestions par enzymes de restriction pour le clonage des gènes gag du patient dans MJ-quatre.

Cette image représentative de gel illustre la séparation électrophorétique de digestions par enzymes de restriction d'un ADN plasmidique purifié de l'ARNm gag chimérique MJ-quatre. Ce graphique montre la reproductibilité du test de réplication dans le temps sur la lignée cellulaire GXR-25. Les mêmes virus chimériques gag MJ-quatre ont été utilisés pour infecter les cellules GXR-25 dans deux expériences indépendantes réalisées à environ un an d'intervalle.

Les scores de réplication ont été obtenus en calculant la pente des valeurs DLU transformées en log et en normalisant cette pente par rapport au type sauvage MJ-four. Les deux mesures indépendantes sont fortement corrélées et soulignent la reproductibilité des tests réalisés à différents moments et avec des cellules à différents passages. Cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine du VIH/sida d'explorer les déterminants viraux de la pathogenèse, lors d'une infection aiguë par le sous-type C, le sous-type le plus répandu dans le monde. Travailler avec un VIH capable de se répliquer peut être extrêmement dangereux. Toutes les étapes impliquant un virus vivant doivent être effectuées dans une installation de niveau de sécurité biologique deux plus. Toutes les surfaces doivent être régulièrement désinfectées et des gants doubles doivent être portés en permanence.