Haute profilage de microARN Débit: Multiplex Optimisé qRT-PCR à l'échelle nanolitres sur l'IFC de Fluidigm ArrayTM dynamique

L'objectif général de cette procédure est de profiler l'expression des microARN de manière efficace, peu coûteuse et avec une quantité minimale de matériel initial, en combinant la R-T-P-C-R quantitative multiplex avec une plateforme microfluidique. Cette procédure commence par la concentration de l'ARN extrait, suivie d'une transcription inverse multiplex et d'une préamplification multiplex. L'étape suivante consiste à purifier l'échantillon en éliminant les amorces en excès.

Enfin, l'expression des microARN est profilée en mode simplexe à l'aide d'une plateforme microfluidique. Le résultat fournit des niveaux d'expression des microARN précis et hautement reproductibles entre les échantillons d'intérêt. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans l'étape de purification supplémentaire effectuée après l'amplification pré-EMP, qui améliore la précision et la reproductibilité de la méthode de PCR-Q-R-T-P en mode multiplex.

Commencez par un ARN extrait du sérum. En utilisant un kit de purification de l'ARN ou une méthode d'extraction de l'ARN basée sur le phénol-chloroforme à partir de tissus homogénéisés comme le triol, toutes les extractions doivent être suivies d'une étape de lavage, et tous les échantillons sont stockés à moins 80 degrés Celsius. Concentrez la solution d'ARN.

Si l'on part d'une quantité limitée d'échantillon, comme par exemple à partir de sérum, insérez un réservoir d'échantillon MicroCon dans un flacon, puis pipetez la solution d'ARN dans le réservoir en prenant bien soin de ne pas toucher la membrane avec la pointe de la pipette. Placez ensuite le flacon et le filtre dans la centrifugeuse avec la bande de repérage orientée vers le rotor, puis effectuez la centrifugation pendant environ trois heures. Après trois heures, l'ARN sera entièrement concentré sur la membrane afin d'éluer l'ARN.

Ajoutez une quantité souhaitée d'eau libre d'ARN à la membrane, retournez le réservoir et placez-le dans un nouveau tube. Ensuite, effectuez une centrifugation pendant trois minutes à quatre degrés Celsius avec un maximum de 3000 ×g. Conservez l'ARN concentré à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Après avoir réalisé une réaction de RT sur l'ARN en utilisant des amorces inverses en boucle palindromique xpl, suivie de 12 à 18 cycles de PCR, les microARN sont représentés par des brins ADNc.

On appelle cela le produit pré-PCR. En référence au QPCR à venir. Le produit pré-PCR doit être purifié sur un gel de polyacrylamide à 10 %, en parallèle d'une échelle d'ADN de 10 paires de bases. Charger chaque puits avec 5,5 microlitres de colorant orange G 6x combiné à 27,5 microlitres de produit pré-PCR.

Faites migrer le gel à 150 volts pendant 55 à 60 minutes. Le bleu de phénol Romo migre sur ce gel dans la région de 20 paires de bases. Après la migration du gel, révélez-le avec de l'or cyber pendant 25 minutes, à l'abri de la lumière et sur un agitateur, à partir du gel coloré.

Prélevez la bande du produit pré-PCR située entre 60 et 80 paires de bases et transférez le morceau de gel dans des tubes étiquetés. Si la concentration du produit est faible, elle peut ne pas être visible, mais le produit sera néanmoins présent dans le gel. Écrasez ensuite la bande de gel par centrifugation tube dans tube et ajoutez 300 microlitres de tampon TEN.

Incuber le mélange tampon-gel pendant quatre heures à 37 degrés Celsius avec agitation. Après quatre heures, transférer le liquide dans un nouveau tube et ajouter 300 microlitres supplémentaires de tampon TEN. Incuber ce mélange toute la nuit à quatre degrés Celsius avec agitation.

Le lendemain, transférez à nouveau le contenu du tube et procédez à une précipitation à l'éthanol du produit pré-PCR. Lorsqu'une puce est sortie de son emballage, elle doit être amorcée dans les 24 heures suivantes, puis chargée dans les 60 minutes suivant l'amorçage. Commencez l'amorçage du réseau en injectant 150 microlitres de fluide de contrôle dans chacun des accumulateurs de la puce.

Veillez à ne renverser aucun liquide sur la puce ou les entrées, sinon la puce deviendra inutilisable. Ensuite, placez la puce dans le circuit fluidique intégré ou le contrôleur IFC et exécutez le script d'amorçage du contrôleur. Dès que le programme démarre, commencez à préparer les échantillons.

Commencez par préparer le mélange d'échantillons pres. Mélangez du tack man, du mélange maître universel et des réactifs de chargement. Ensuite, en utilisant le format de chargement en plaque de 96 puits, combinez 2,25 microlitres de chaque échantillon avec 2,75 microlitres du mélange d'échantillons pres pour recueillir le liquide chargé. Vortexez brièvement et centrifugez rapidement la plaque à 4 degrés Celsius.

La plaque d'échantillons est désormais prête. Utilisez maintenant une nouvelle plaque de 96 puits pour préparer des concentrations 13 x du mélange d'essai. Cela se fait en mélangeant, par puits, un amorceur universel, un amorceur direct et une sonde TaqMan spécifique au gène.

Les concentrations en X sont de un micromolaire pour l'amorce universelle et l'amorce sens, et de 0,2 micromolaire pour la sonde TaqMan. Ajouter ensuite suffisamment de Tween pour obtenir une concentration finale de 0,25 % de Tween dans un volume final par puits de cinq microlitres. Mélanger soigneusement en évitant les bulles et centrifuger brièvement la plaque pour rassembler le liquide.

Il s'agit de la plaque de dosage. Commencez le 96.96 Q-R-T-P-C-R en chargeant la puce. Chargez d'abord les échantillons, puis les dosages, avec un volume final de cinq microlitres par entrée dans le IFC.

Deuxièmement, exécutez le script de mélange de chargement pour introduire les échantillons et les tests dans la puce. Une fois le script terminé, retirez délicatement le film protecteur de la puce chargée et éliminez toute particule de poussière ou débris présents sur la surface de la puce à l’aide d’un ruban adhésif. Configurez maintenant le programme d’amplification du système biologique.

Chargez la puce dans le système et exécutez le programme. Les résultats peuvent être analysés à l'aide du logiciel fluid dime afin d'obtenir des courbes d'amplification, des cartes thermiques de l'ensemble de la puce et des valeurs CT pour chaque puits, en utilisant des produits pré-PCR purifiés par séparation selon la taille sur des gels natifs de polyacrylamide, l'allèle sauvage DG CR huit et le mutant nul d'ER.

L'ARN a été préparé par rapport aux protocoles précédents. Un plus grand nombre de microARN et une réduction des signaux faux positifs sont observés dans les deux contextes DGCR huit nul et ER nul grâce à l'étape de purification. De plus, l'approche modifiée de QR TPCR R permet la catégorisation correcte des rares petits ARN indépendants de D gcr huit et dépendants de Dicer.

Ici, 48 céra provenant de patients et de témoins ont été analysés afin de détecter des modifications d'expression de 384 microARN différents. Les données ont été normalisées pour chaque échantillon en soustrayant la médiane correspondante, sans utilisation de témoin d'ajout dans les contrôles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière dont la Q-R-T-P-C-R multiplexe sur une plateforme flu line peut être utilisée pour profiler simultanément des centaines de micronases à partir de nombreux échantillons, même lorsque la quantité initiale d'ARN est très faible.