Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

L'objectif général de cette procédure est de permettre une mise en place rapide et fiable, de manière automatisée, de puces basées sur la PCR quantitative. Cela est réalisé en préparant d'abord les jeux d'amorces pour la puce et en préparant les mélanges maîtres d'échantillons à analyser. Ensuite, soit un système robotisé automatisé de préparation de PCR, soit un système de pipette électronique matricielle est utilisé pour distribuer avec précision le mélange maître d'échantillon et les jeux d'amorces dans chaque puits d'une plaque de 384 puits.

Une fois préparées, les réactions PCR en plaques de 384 puits sont effectuées selon le programme PCR basé sur le Light Cycler 480. La dernière étape de la procédure consiste à analyser les données de QPCR et à déterminer les niveaux d'expression relative pour chaque paire d'amorces testée, chacune ciblant un ARNm spécifique. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant des variations de l'expression de vastes ensembles d'ARNm.

Des puces spécifiquement conçues peuvent donc cibler l'ensemble des profils de microARN précurseurs, ou des voies spécifiques ou des molécules clés dans l'infection virale, grâce à un profilage basé sur la PCR quantitative. Bonjour, je suis Dirk DMA du Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment mettre en place une PCR quantitative en temps réel, et nous vous présenterons deux méthodes.

Une méthode utilisant une pipette irrégulière et une autre utilisant un robot. Nous utilisons cette technologie pour mesurer les pré-microARN et les microARN matures dans les tumeurs humaines. La démonstration d'aujourd'hui sera réalisée par Pauline Chu et Kristen bu.

Commençons. Pour commencer cette procédure, récupérez les plaques d'amorces contenant 186 paires d'amorces dans un format 96 puits à 0,5 picaMoles, stockées à moins 20 degrés Celsius.

Après avoir décongelé les plaques à température ambiante, vortexez-les et centrifugez-les brièvement. Décongelez également par deux fois le mélange PCR au vert cyber à température ambiante. Pour la préparation de chaque plaque de 96 puits avec amorces, quatre tubes de mélange maître seront nécessaires. Préparez le mélange maître en combinant quatre microlitres de mélange vert cyber, trois microlitres d'eau de qualité PCR et 10 à 20 nanogrammes d'ADN ou d'ADNc échantillon par réaction dans chacun des quatre tubes Eppendorf de deux millilitres.

Chaque tube doit contenir suffisamment de mélange maître pour environ 100 réactions, en prévoyant un excès pour compenser les pertes lors du pipetage. Vortexer les tubes einor pour homogénéiser. Commencer la mise en place du test de microARN précurseur en utilisant le robot Tecan EVO, en initialisant le robot et en chargeant le programme EVO wear.

Ensuite, rincez le robot trois fois avec 30 millilitres de liquide système afin d'éliminer les bulles d'air qui pourraient nuire à la précision du pipetage. Puis, configurez la plateforme robotisée pour inclure une plaque de 384 puits et une plaque de 96 puits contenant les amorces. Les mélanges maîtres se trouvent dans un réservoir contenant 2 % de javel, un contenant de liquide système rempli, et un contenant de déchets vide.

Lancez l'exécution automatisée du robot en sélectionnant deux fois « exécuter » à la fin du programme. Retirez la plaque 384 puits et scellez-la avec du film d'étanchéité Light Cycler quatre 80 pour plafond. Ensuite, centrifugez la plaque.

Placer brièvement la plaque scellée de 384 puits en position un de l'hôtel. Répéter ensuite ce processus pour la plaque d'amorces deux avec de nouveaux mélanges maîtres et une nouvelle plaque de 384 puits. Placer la plaque de 384 puits scellée résultante en position deux de l'hôtel.

Ouvrez un nouveau programme EVO Wear pour le chargement du cycliseur lumineux à partir de l'hôtel et définissez les paramètres de cyclage. Ensuite, sélectionnez « exécuter deux fois ». Le Freedom Evo chargera automatiquement chaque plaque dans le cycliseur lumineux et exécutera le programme de cyclage HRM au vert cyber.

Une fois terminé, examiner et analyser les résultats comme décrit dans le protocole écrit, en alternative à l'utilisation du robot. Une pipette multipipette électronique matricielle peut être utilisée pour commencer à transférer le contenu du tube de mélange maître dans un réservoir.

Régler la pipette électronique pour aspirer 16 microlitres de mélange maître avec deux étapes de distribution de huit microlitres suivies d'une étape de purge. Après avoir réglé la pipette, aspirer 16 microlitres de mélange maître et commencer à distribuer dans une plaque en forme de roue 384. Distribuer les premiers huit microlitres dans chaque autre rangée de la colonne un en utilisant les rangées A à O, en laissant la colonne suivante vide.

Dispensez les huit microlitres suivants dans les mêmes lignes de la colonne trois. Ensuite, purgez au-dessus d'un récipient de déchets et jetez les pointes en suivant ce schéma laissant des lignes alternées et des colonnes alternées. Effectuez la distribution sur la plaque pour cinq cycles supplémentaires afin de pipeter le mélange maître deux.

Utilisez les mêmes rangées que pour le mélange maître un, mais commencez par la colonne deux. Répétez cette procédure pour les mélanges maîtres trois et quatre, en commençant respectivement par les colonnes un et deux, mais cette fois en utilisant la rose B jusqu’à P.Her en citant la plaque d’amorces. Réglez une pipette électronique pour aspirer deux microlitres et distribuer deux microlitres, suivis d’une étape de purge.

Transférez deux microlitres d'amorces de la colonne un, ligne A à H d'une plaque d'amorces de 96 puits vers chaque autre colonne un des lignes de la plaque de 384 puits ; purgez au-dessus d'un récipient de déchets et jetez les pointes. Répétez ce schéma pour chaque amorce avec les trois mélanges maîtres restants des colonnes un et deux. Puis poursuivez ce processus pour les colonnes deux à douze de la plaque d'amorces de 96 puits, en avançant de deux colonnes à chaque fois dans la plaque de 384 puits pour chaque colonne d'amorces.

Ensuite, scellez les plaques avec un couvercle de cycler léger, du papier d'aluminium et centrifugez. Après une brève centrifugation, placez les plaques dans un light cycler four 80 et effectuez les cycles des plaques en utilisant le format de détection HRM cyber green one.

En utilisant les mêmes conditions de cyclage qu’auparavant, répétez cette procédure en employant la plaque d’amorces deux Eloqua dans une nouvelle plaque de 384 puits, avec des mélanges maîtres fraîchement préparés. Les signatures des microARN précurseurs émergent grâce au profilage à l’aide d’un nouveau tableau basé sur la PCR quantitative. La valeur moyenne du delta CT, normalisée par rapport à U six, a été calculée et les valeurs standardisées ont été chargées dans le tableau.

Logiciel mineur produisant trois groupes distincts affichés sous forme de cartes thermiques. L'expression relative de chaque microARN précurseur est indiquée, le rouge et le bleu représentant respectivement une augmentation et une diminution de l'expression relative. L'intensité de la couleur indique le degré de changement d'expression.

La majorité des microARN précurseurs ont subi de légers changements non significatifs, comme prévu. Toutefois, une petite fraction des microARN précurseurs a augmenté significativement au cours de l'expérience temporelle. De plus, le niveau relatif de certains microARN précurseurs a diminué de façon spectaculaire.

Dans certains cas, ils forment également des groupes regroupés lors de l'analyse de la carte thermique. Selon l'expérience, des groupes peuvent apparaître en fonction de l'infection virale, de l'expression spécifique au type cellulaire des microARN précurseurs ou des microARN précurseurs régulés par une molécule commune ou une voie de signalisation.

Les seuils de cycle moyens ou CT d'un échantillon négatif au virus d'herpès associé au sarcome de Kaposi, analysé en quadruple duplication, sont indiqués. Il est important de noter que l'antigène nucléaire associé à la latence du virus d'herpès associé au sarcome de Kaposi, ou KSHV LANA, n'a pas été détecté dans cet échantillon par la matrice QPCR hautement sensible. En revanche, le contrôle interne U six et let seven a, un précurseur d'ARN micro-ARN humain fortement exprimé, étaient tous deux exprimés à des niveaux détectables.

Enfin, comme prévu, le témoin négatif constitué d'eau de qualité PCR n'a pas produit de produit A-Q-P-C-R. Analyse de courbe de fusion pour deux amorces différentes. Le même échantillon en double est présenté.

Il est clair que la température de fusion est différente pour les deux paires d'amorces, mais l'échantillon fond à la même température exacte pour chaque réplicat. Des signes d'un mauvais échantillon ou potentiellement contaminé peuvent inclure plusieurs pics de fusion suggérant la présence de deux sources différentes d'ADN d'entrée. Nous venons de vous montrer comment configurer une expérience de PCR quantitative en temps réel en utilisant un robot.

Il est important que vous incluiez toutes les conditions témoins et un nombre aussi élevé que possible de gènes de référence. Nous vous remercions donc d'avoir regardé cette vidéo et vous souhaitons bonne chance dans vos expériences.