Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de l'apoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement

L'objectif général de cette procédure est de surveiller les variations de la concentration calcique mitochondriale dans des cellules vivantes. Cela est réalisé en transfectant d'abord les cellules avec la protéine indicatrice calcique rapport métrique peram, ciblée vers la matrice mitochondriale, un ou deux jours après le transfection. Le microscope à fluorescence et le logiciel sont configurés pour l'imagerie de cellules vivantes.

Des images de cellules exprimant un indicateur rapport métrique sont ensuite acquises après l'ajout d'un agoniste mobilisant le calcium. La dernière étape de la procédure consiste en une analyse quantitative des images acquises. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les changements dynamiques de la concentration en calcium mitochondrial par microscopie de fluorescence de cellules vivantes exprimant une protéine indicatrice du calcium à rapport métrique.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la mesure des niveaux de calcium à l’aide d’indicateurs synthétiques de calcium, est que le rapport métrique de peram est codé génétiquement et peut donc être ciblé vers les mitochondries ou tout autre organite d’intérêt. Bonjour, je suis le Dr. Ascar, postdoctorant dans le laboratoire du Dr. Benning, et je vais démontrer la procédure aujourd’hui. Pour commencer le protocole, plaquez les cellules HeLa la veille de la transfection sur des lamelles de verre stériles placées dans une plaque de culture standard à six puits, à une densité permettant d’obtenir environ 70 % de confluence le jour de la transfection. Le jour suivant, préparez des complexes ADN-Lipofectamine 2000 selon les instructions du fabricant, en utilisant quatre microgrammes de vecteur d’expression mitochondrial du rapport métrique de peram et 10 microlitres de Lipofectamine 2000 dilués dans 0,5 millilitre d’Opti-MEM pour chaque puits à transfecter.

Ensuite, remplacez le milieu de culture D-M-E-M-F-B-S HELOC dans chaque puits par 1,5 millilitre du même milieu sans antibiotiques. Ajoutez la solution LIPECTOMY à la solution d'ADN et mélangez délicatement une fois les complexes formés. Ajoutez la solution d'ADN Lipectomy goutte à goutte dans chaque puits à transfecter en agitant doucement la plaque, puis incubez pendant quatre heures dans une étuve à culture cellulaire à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, après l'incubation.

Remplacez le milieu par du D-M-E-M-F-B-S contenant des antibiotiques. Laissez les cellules exprimer la métrique peram pendant un à deux jours avant l'imagerie en utilisant une pince. Placez délicatement une lame couvre-objet avec des cellules HELOC dans une chambre d'imagerie appropriée contenant la solution d'imagerie.

Montez la chambre d'imagerie sur la platine d'un microscope inversé. Ensuite, utilisez un objectif à immersion huile de 40 x ou supérieur et une longueur d'onde de 380 nanomètres. Pour localiser une zone d'intérêt contenant une ou plusieurs cellules exprimant la protéine rapporteur, une longueur d'onde de 380 nanomètres est utilisée ici afin d'identifier les cellules comme étant rapportrices.

La peram est moins résistante au photoblanchiment à cette longueur d'onde. Une fois qu'une zone d'intérêt a été identifiée, configurez le logiciel pour une double excitation à 495 et 380 nanomètres. Ensuite, acquérez les images séquentiellement en excitant alternativement à 495 et 380 nanomètres.

Acquérir des images des niveaux de calcium de base pendant au moins 30 secondes avant l'application de l'agoniste. Appliquer ensuite l'agoniste mobilisant le calcium à l'aide d'un appareil de perfusion, en notant le moment de l'ajout ; les durées d'exposition à l'agoniste et les intervalles d'acquisition doivent être optimisés afin de prévenir le photoblanchiment tout en permettant une résolution temporelle suffisante. Une fois l'expérience terminée, les images peuvent être analysées hors ligne.

Pour commencer l'analyse, sélectionnez une région d'intérêt dans une zone vide du champ afin de soustraire la fluorescence de fond si nécessaire. Ensuite, exportez les mesures de rapport 4 95 3 80 provenant de la région d'intérêt vers Excel ou un logiciel graphique similaire. Ce panneau d'images montre la localisation subcellulaire du rapport métrique de peram et des mitochondries.

À gauche, on voit une image de cellules vivantes de cellules HeLa exprimant Peram à rapport métrique. Au centre, la coloration fluorescente des mitochondries avec le colorant sélectif MitoTracker Red CMXRos. Enfin, à droite, l'image fusionnée présentée ici correspond à une série d'images en pseudocouleurs obtenues par un rapport d'excitation à 495 et 380 nanomètres, montrant quatre cellules HeLa exprimant Peram à rapport métrique dans les mitochondries, traitées avec 10 micromolaire de ATP ; la quantification des variations des concentrations de calcium mitochondrial de ces quatre cellules précédentes est illustrée ici sur une image d'une cellule HeLa exprimant Peram à rapport métrique dans les mitochondries.

Hétérogénéité de la réponse calcique au niveau des mitochondries individuelles ainsi qu'une fragmentation mitochondriale importante sont observées après 60 minutes de traitement par 0,5 micromolaire de stor sporine. Certaines mitochondries présentent des augmentations oscillatoires du calcium, indiquées par la flèche blanche, tandis que d'autres ne montrent pas de changements significatifs du taux de calcium, indiqués par une flèche jaune. Ce graphique met en évidence la variation des niveaux globaux de calcium mitochondrial dans une cellule helo unique après induction de l'apoptose pendant 120 minutes avec 0,5 micromolaire de stor sporine.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer les changements dynamiques des concentrations de calcium mitochondrial en réponse à divers tli à l’aide de la protéine indicatrice de calcium R geometric peram, qui est ciblée de manière sélective vers la matrice mitochondriale.