Détection des modifications post-traductionnelles sur les autochtones nucléosomes Intact par ELISA

L'objectif général de cette procédure est de déterminer avec précision les niveaux relatifs des modifications post-traductionnelles au sein de préparations de nucléosomes cellulaires totaux obtenus à partir d'un million de cellules. Cela est réalisé en préparant d'abord des cultures homogènes de haute qualité de cellules de mammifères. Ensuite, les noyaux sont isolés des cellules par disruption mécanique à l'aide d'un homogénéisateur Dounce et par centrifugation.

L'étape suivante consiste à obtenir des nucléosomes intacts en digérant la chromatine présente dans les noyaux et en effectuant une série d'extractions hypotoniques. Enfin, les nucléosomes sont analysés à l'aide d'un test ELIZA avec les contrôles appropriés afin d'identifier des modifications post-traductionnelles spécifiques. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant les niveaux relatifs de modifications spécifiques présentes dans les échantillons de nucléosomes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le western blot et l'immunoprécipitation de chromatine est qu'une vue d'ensemble de plusieurs états de modification des nucléosomes peut être facilement déterminée. La méthode est nettement plus sensible et plus précise que le western blot et peut être réalisée dans la plupart des laboratoires équipés pour des expériences de biologie moléculaire générale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines des cellules souches et de l'épigénétique, comme par exemple ce qui se produit lors d'événements majeurs de différenciation et de reprogrammation.

Pour commencer la procédure, commencez par trypsiner les cellules avec trois millilitres de trypsine par plaque de 15 centimètres afin d'obtenir des cellules fraîchement trypsinisées. Ajoutez 20 millilitres de PBS froid additionné de butyrate. Transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres et centrifugez le tube pour recueillir les cellules à 1000 tr/min pendant cinq minutes, aspirez le surnageant et ajoutez 10 millilitres de PBS froid additionné de butyrate pour laver les cellules ; centrifugez à nouveau la suspension cellulaire à 1000 tr/min pendant cinq minutes.

Éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans quatre millilitres de tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéases, comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, prélever les cellules à la pipette et les transférer dans un homogénéisateur à piston de type B, puis homogénéiser sur glace à l’aide de 20 allers-retours. Transférer ensuite l’homogénat dans un tube à centrifuger placé sur glace.

Centrifuger l'échantillon à 2000 G pendant 10 minutes, à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant, qui contient le matériel cytoplasmique et les resus.

Suspendez le culot dans deux millilitres de tampon de lavage C froid avec des inhibiteurs de protéases, puis déposez délicatement le matériau resuspendu sur un coussin de cinq millilitres de saccharose à 30 % dans un tube de centrifugeuse froid. Pour isoler les noyaux, effectuez une centrifugation à 2 400 ×g pendant cinq minutes dans un rotor à godets oscillants ; les noyaux migrent à travers le coussin tandis que les débris cellulaires restent à l'interface. Après la centrifugation, retirez soigneusement tout le volume liquide et resuspendez les noyaux dans 250 microlitres de tampon de lavage C froid contenant des inhibiteurs de protéases, puis transférez les noyaux dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Pour commencer l'isolement des nucléosomes, ajoutez trois microlitres de chlorure de calcium 0,1 molaire aux noyaux et placez-les dans un bloc chauffant à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que la température soit équilibrée. Ajoutez ensuite deux unités de micrococcal nuclease dans 10 microlitres de tampon micrococcal nuclease, et incubez pendant 12 minutes à 37 degrés Celsius. Mélangez fréquemment à l’aide d’une pointe de pipette.

Après l'incubation, arrêter la réaction avec six microlitres de E-D-T-A de sodium 0,5 molaire à pH 8 et placer sur de la glace pour refroidir. Ensuite, centrifuger l'échantillon à 2000 ×g pendant quatre minutes ; après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 300 microlitres de E-D-T-A de sodium 0,2 millimolaire. Incuber l'échantillon sur glace pendant une heure, en mélangeant par pipetage doux et occasionnel.

Après une centrifugation à 3000 G pendant quatre minutes, à quatre degrés Celsius, recueillir le surnageant, qui contient les nucléosomes libres, dans un nouveau tube Eppendorf et le conserver sur de la glace pour une réutilisation ultérieure des nucléosomes supplémentaires. Suspendre le culot dans 300 microlitres de 0,2 millimole d'EDTA au sodium comme précédemment et incuber sur de la glace pendant une heure avec un mélange doux occasionnel.

Après l'incubation, centrifuger l'échantillon. Ensuite, combiner le surnageant obtenu avec le reste de l'échantillon dans le tube de microcentrifugeuse placé sur de la glace. Pour commencer le test Eliza des nucléosomes, charger une plaque Eliza de 96 puits avec une série descendante de cinq dilutions sérielles deux fois consécutives de nucléosomes et de tampon de revêtement, en commençant par 0,1 microgramme par 50 microlitres dans le puits supérieur ; chaque série de dilutions doit être chargée en triple exemplaire.

N'oubliez pas d'inclure des puits contenant uniquement le tampon de revêtement comme témoins. Incubez la plaque toute la nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant. Utilisez un laveur de plaques pour laver les puits avec 200 microlitres par puits de PBS contenant 0,5 % de Tween 20 à température ambiante, quatre fois au total, pour une durée cumulée de 10 minutes.

Ajoutez maintenant 100 microlitres par puits de solution de blocage et incubez pendant une heure à température ambiante sur un agitateur rotatif. Après l'incubation, éliminez le tampon de blocage en secouant énergiquement la plaque retournée au-dessus d'un évier. Ensuite, ajoutez l'anticorps primaire dilué dans un volume de 50 microlitres par puits dans une solution de 5 % de PSA dans 0,05 % de Tween 20 dans du PBS, et incubez la solution pendant une heure sur un agitateur rotatif à température ambiante.

Après l'incubation avec l'anticorps primaire, laver les plaques comme précédemment à l'aide du laveur de plaques. Une fois le cycle de lavage terminé, ajouter 50 microlitres par puits d'anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort, dilué dans du PBS contenant 5 % de BSA et 0,5 % de Tween 20, puis incuber une heure à température ambiante sur un agitateur rotatif après l'incubation avec l'anticorps secondaire. Laver ensuite les plaques comme précédemment.

Utilisation du laveur de plaques pour développer la plaque. Ajouter 50 microlitres de substrat TMB Eliza dans chaque puits et incuber pendant 10 minutes. À température ambiante, les puits de la plaque ELIZA deviennent bleus et l'intensité est proportionnelle à la quantité de modifications des nucléosomes présentes dans chacun d'eux.

Arrêtez alors la réaction en ajoutant 50 microlitres par puits d'acide sulfurique deux normal. La couleur vire au brun ; centrifugez la plaque à 1500 tr/min pendant deux minutes afin d'éliminer les bulles d'air éventuelles.

La plaque est désormais prête à être quantifiée à l'aide d'un lecteur de plaques en mode colorimétrique. Enfin, lire la plaque à 450 nanomètres et exporter les résultats pour analyse. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les cellules souches pour explorer les réponses épigénétiques aux événements de différenciation et de reprogrammation au niveau de tout l'épiprotoome.