Piège chromosomes associés pour identifier les interactions ADN à longue distance

L'objectif général de l'expérience suivante est de découvrir et d'identifier des partenaires d'ADN associés à longue distance. Cette approche est réalisée par une fixation, une lyse cellulaire et une digestion de l'ADN par la première enzyme de restriction, suivie d'une ligature afin de créer un ADN chimérique composé de segments provenant des deux gènes associés. Ensuite, des adaptateurs sont ajoutés à l'ADN chimérique après la seconde digestion par une enzyme de restriction, afin de faciliter son amplification. Une amplification par PCR est alors effectuée à l'aide d'amorces spécifiques aux adaptateurs et à l'ADN cible (« appât »), permettant d'obtenir des quantités suffisantes de fragments d'ADN associés. Les résultats obtenus révèlent les partenaires d'ADN associés à longue distance avec l'ADN appât, sur la base de l'analyse de séquence des fragments d'ADN amplifiés.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le piégeage de la confirmation des chromosomes ou le 3C réside dans le fait que l'ACTSA peut être utilisée pour identifier efficacement un partenaire d'ADN associé à longue distance inconnu, alors que le 3C a été développé pour la vérification d'interactions uniquement déjà suspectées auparavant. Pour commencer ce protocole, cultiver des cellules humaines dans un incubateur alimenté en 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 80 à 90 %.

Des cellules de leucémie aiguë promyélocytaire humaines sont utilisées pour cette démonstration. Recueillir les cellules en les versant dans un tube NOC de 50 millilitres et centrifuger à 1200 tr/min pendant 15 minutes. Après la centrifugation, éliminer le milieu par aspiration.

Ajoutez cinq millilitres de milieu de culture pour resuspendre les culots cellulaires. Après avoir dénombré les cellules à l'aide d'un hémocytomètre, prélevez environ un fois dix puissance sept cellules et complétez à un volume de 40 millilitres avec le milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS. Ajoutez ensuite 1,7 millilitre de formaldéhyde à 37 % pour fixer la chromatine diluée.

Incuber l'échantillon à température ambiante pendant 10 minutes avec agitation douce. Après l'incubation, arrêter la réaction avec 2,4 millilitres de glycine deux molaire. Ensuite, centrifuger l'échantillon pendant 15 minutes à 1200 tr/min et à quatre degrés Celsius.

Après avoir éliminé le surnageant, lavez le culot une fois avec 40 millilitres de PBS glacé, puis centrifugez l'échantillon afin de récupérer le culot cellulaire lavé. Resuspendez le culot obtenu dans 40 millilitres de tampon de lyse glacé contenant des inhibiteurs de protéases fraîchement ajoutés et du PMSF à 0,1 millimolaire. Incubez l'échantillon dans une chambre froide sous agitation rotative pendant 90 minutes. Enfin, centrifugez l'échantillon à 2 500 tr/min pendant 15 minutes, éliminez le surnageant et récupérez les noyaux isolés. Resuspendez les noyaux dans 0,5 millilitre de tampon NEB 1X et ajoutez 15 microlitres de SDS à 10 %.

Incuber l'échantillon à 37 degrés Celsius pendant une heure sous agitation. Ajouter ensuite 45 microlitres de Triton X-100 à 20 % pour piéger le SDS et incuber à nouveau à 37 degrés Celsius pendant une heure sous agitation, avec un aliquot de un fois 10 à la puissance six. Les noyaux, soit environ 15 microgrammes, sont utilisés pour la digestion par une enzyme de restriction dans 55 microlitres de solution de noyaux.

Ajouter 433 microlitres d'un tampon XNEB trois et 12 microlitres de BGL deux. Pour obtenir un volume total de réaction de digestion de 500 microlitres, incuber la réaction à 37 degrés Celsius toute la nuit. Le jour suivant, inactiver l'enzyme de restriction en ajoutant 95 microlitres de SDS à 10 % et dénaturer l'enzyme en chauffant à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Dans un bain-marie, ajoutez sept millilitres de tampon de ligature 1 x et 360 microlitres de Triton X-100 à 20 %. Incubez l'échantillon à 37 degrés Celsius pendant une heure. Abaissez la température à 16 degrés Celsius et ajoutez 50 microlitres de 400 unités par microlitre.

Ligasez l'ADN avec la ligase T4. Incubez la réaction de ligature à 16 degrés Celsius pendant quatre heures, puis à température ambiante pendant 30 minutes. Une fois la ligature terminée, ajoutez 300 microgrammes de protéinase K et incubez à 65 degrés Celsius toute la nuit.

Ensuite, ajoutez cinq microgrammes de RNAA et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Purifiez l'ADN par extraction au phénol-chloroforme et précipitez l'ADN dans l'isopropanol ; dissolvez l'ADN précipité dans 150 microlitres d'eau distillée stérile. Pour ajouter des linkers à l'ADN chimérique, digérez d'abord l'ADN en incubant deux microgrammes d'ADN purifié avec cinq unités de msp, une à 37 degrés Celsius pendant quatre à six heures. Après la digestion, inactiver MSP une à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, précipitez l'ADN dans l'éthanol avec un microlitre de glycogène à cinq milligrammes par millilitre. Dissolvez le culot d'ADN obtenu dans 50 microlitres d'eau distillée stérile. Puis mélangez 50 microlitres d'ADN traité par MSP1 avec deux microlitres d'un oligonucléotide adaptateur (linker) L à 20 micromolaire et un microlitre d'un oligonucléotide S à 20 micromolaire, ajoutez ensuite un microlitre d'eau distillée stérile et six microlitres de tampon 10 X pour l'ADN ligase T4.

Couvrez le mélange avec de la cire liquide. Dénaturez les oligonucléotides à 50 degrés Celsius pendant une minute, puis laissez refroidir progressivement jusqu'à 10 degrés Celsius selon un gradient de 0,5 degré Celsius par minute. À l'aide d'un thermocycleur, ajoutez un microlitre de ligase T4 ADN à 400 unités par microlitre et incubez la réaction à 15 degrés Celsius toute la nuit.

Le jour suivant, purifiez l'ADN ligaturé au brin intermédiaire à l'aide d'un kit de purification rapide d'ADN PCR Kaya et élué dans 50 microlitres d'eau distillée stérile. Ensuite, choisissez un amorçage pour la région spécifique d'ADN à étudier en ce qui concerne les interactions à longue distance. Dans cet exemple, Abel sera utilisé comme amorçage ou comme appât.

Préparez l'ADN purifié pour la première PCR en combinant un microlitre d'ADN purifié avec un microlitre de 20 micromolaire du premier amorce spécifique, 46 56, et un microlitre de 20 micromolaire de l'amorce spécifique du linker 29 63. Ajoutez ensuite trois microlitres de trois x ClinTech, un cocktail de polymérase ADN préalablement mélangé avec du 32 P-D-C-T-P conformément au protocole écrit, suivi de trois microlitres d'eau distillée stérile. Réalisez l'amplification par PCR en utilisant le cycle thermique PCR à démarrage à chaud décrit dans le protocole écrit après la fin du cycle PCR.

Purifiez les produits de la première PCR à l'aide d'un kit de purification rapide PCR Kaya. Élué dans 30 microlitres d'eau distillée stérile. Utilisez un microlitre du produit de la première PCR dilué 100 fois pour effectuer un deuxième tour de PCR en utilisant des amorces imbriquées, en ajoutant un microlitre d'une amorce spécifique à l'aptamère de 20 micromolaire, 46 26, et un microlitre d'une amorce spécifique au linker de 20 micromolaire, 29 61.

À nouveau, ajouter trois microlitres de trois x ClinTech, de l'ADN polymérase, un cocktail et trois microlitres d'eau distillée stérile. Réaliser le deuxième cycle de PCR en utilisant un programme de thermocyclage de 25 cycles à 95 degrés Celsius pendant 20 secondes, 67 degrés Celsius pendant 40 secondes et 72 degrés Celsius pendant une minute, suivi d'une extension à 72 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Visualisez les produits de PCR en faisant migrer un gel PAGE contenant 5 % d'urée, puis en analysant l'écran exposé à l'aide d'un imageur à phosphorimagerie. Chaque bande de PCR peut être récupérée à partir du gel en dissolvant les bandes de gel dans un tube Eppendorf contenant 60 microlitres d'eau distillée stérile et en incubant à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Faites une courte centrifugation des produits de gel dissous à 10 000 tr/min pendant 10 secondes.

Pour collecter tous les échantillons. Prélever un microlitre à utiliser comme matrice d'ADN pour réaliser la PCR avec le prime repair. 29 61 46 26.

En utilisant les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus, après la purification, une analyse de séquençage peut être effectuée à l’aide d’un outil en ligne afin de déterminer la localisation chromosomique. Une fois sur le site de bioinformatique génomique, cliquez sur blatt pour ouvrir une nouvelle fenêtre et collez la séquence d’ADN. Après avoir soumis la séquence d’ADN, les résultats de la recherche BLATT s’afficheront.

Cliquez sur le résultat présentant une identité de 100 % dans le navigateur pour révéler l'emplacement de la séquence d'ADN. La région able one a été utilisée comme amorces pour déterminer ses interactions d'ADN à longue distance. Deux sites BGL two et un site BAM H one ont été choisis pour le test A CT lors du deuxième tour de jeu d'amorces de PCR ; 46 26 29 61 a été utilisé pour amplifier able M1 ; 46 30 29 61 a été utilisé pour able M two ; et 46 36 29 61 a été utilisé pour able M three.

Un profil de gel typique révèle une à plusieurs bandes, comme illustré ici pour les clones able M1, able M2 et able M3. La séquence d'ADN du clone able M1 est présentée afin de démontrer que chaque fragment issu d'un test A CT est constitué de deux segments d'ADN combinés. L'un de ces segments provient de la région d'ADN appât, tandis que le second segment provient du partenaire associé.

Les segments sont reliés les uns aux autres par la première séquence de reconnaissance de l'enzyme de restriction. La séquence de reconnaissance de la deuxième enzyme apparaîtra à la fin de la séquence partenaire associée. Le fragment M1 clonable contient de l'ADN provenant de la région ABLE un située sur le chromosome neuf Q 32,4, et le partenaire associé est situé sur le chromosome trois P trois, qui a été identifié comme proc deux.

De même, le partenaire associé M deux a été localisé sur le chromosome cinq Q 21,1, tandis que le clone M trois a été identifié comme une association intrachromosomique près du locus ABLE un, contrairement aux essais trois C. La méthodologie décrite dans cette vidéo permettra de sélectionner les interactions à longue distance les plus fréquentes. Toutefois, en augmentant le nombre de cycles de PCR, il est possible d'identifier également des associations supplémentaires, moins fréquentes, en utilisant la région d'empreinte et de contrôle ou ICR du locus IGF deux H 19 comme ADN appât dans des cellules de fibroblaste de souris ; différents programmes de cyclage ont été appliqués lors des premier et deuxième tours de PCR dans l'essai A CT.

Le test A CT peut également être utilisé pour identifier les différences dans l'architecture nucléaire et les interactions à longue distance entre les cellules normales et les cellules cancéreuses. Des tissus coliques normaux et des tissus de cancer du côlon ont été homogénéisés, puis le test A CT a été réalisé selon les procédures décrites ici. On observe ici la structure de l'ADN de la région ICR au locus IGF two H 19 et du gène IGF two dpn.

Deux sites pour le test A CT sont indiqués ; les amorces utilisées lors de la PCR du deuxième tour sont marquées par des flèches et des numéros de différentes couleurs. Le profil sur gel du test A CT représente les résultats de la PCR utilisant l'amorce 29 61 avec l'une des paires d'amorces suivantes : 41, 61, 41 63, 51 45 et 51 51. Les bandes uniques qui apparaissent uniquement dans le tissu colique normal sont indiquées par des flèches jaunes, tandis que les bandes présentes uniquement dans le tissu de cancer du côlon sont marquées par des flèches rouges après leur mise au point.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du marché pour explorer l'architecture nucléaire et la régulation des gènes de manière tridimensionnelle.