Imagerie C. elegans Les embryons en utilisant un microscope à épifluorescence et de logiciels Open Source

Ce protocole montre comment imager des événements dynamiques dans les embryons précoces de CL egan à l’aide d’optiques DIC Norky ou de fluorescence, en utilisant des microscopes largement disponibles et des logiciels libres. Le protocole commence par la description de la dissection des embryons de CL gans et de leur montage pour l’imagerie. Ensuite, le réglage adéquat des optiques DIC à masque Norky est passé en revue afin d’obtenir des images optimales avec le plus grand détail.

L'étalonnage de la fluorescence en champ large et de l'éclairage est également passé en revue pour acquérir de bonnes données d'images fluorescentes, en association avec un logiciel open source. Une bonne microscopie permet de visualiser la dynamique cellulaire au cours du développement d'un embryon. Des illustrations visuelles de cette méthode sont essentielles, car la configuration correcte des optiques D iic est difficile, la terminologie pouvant prêter à confusion et la technique adéquate étant ardue à décrire par écrit.

En outre, les chercheurs doivent être prudents afin de minimiser l'exposition à la lumière lors de l'acquisition d'images en fluorescence. Afin de limiter la phototoxicité et le photoblanchiment, préparez d'abord deux solutions de montage. L'une est du Vaseline fondu et l'autre est une solution de deux à 3 % d'aros dans un tampon.

Des aros plus denses peuvent être préparés si les structures à imager sont très fragiles, en prenant soin d'éviter toute ébullition. Les deux solutions stock sont fondues au micro-ondes, puis conservées en aliquotes de quatre à cinq millilitres. Le jour de l'observation, faire fondre une aliquote de solution de vaseline dans un bloc chauffant à 65 à 70 degrés Celsius et faire fondre une aliquote de solution d'arose au micro-ondes.

À nouveau, éviter l'ébullition. Ensuite, pour maintenir ces solutions à l'état liquide, les conserver dans un bloc chauffant. Puis, recouvrir le haut et le bas de deux lames par une bande de ruban adhésif de laboratoire et placer une lame propre entre les deux lames recouvertes de ruban.

Prélève maintenant quelques gouttes de l'aros fondu sur une lame propre et recouvre-la avec une autre lame propre. L'aros s'étend en une pastille carrée fine, préparée avec la pastille de vers. Utilise un microscope stéréoscopique et une aiguille en platine pour transférer deux vers adultes dans une goutte de tampon de neuf à douze microlitres sur une lamelle de 18 par 18 millimètres.

Ensuite, coupez. Ouvrez les vers avec une aiguille ou un scalpel pour libérer les embryons, en gardant le côté en agar vers le bas. Placez le tampon à vers sur la lamelle de 18 sur 18 millimètres et rasez tout excès d'agar.

Enfin, pour sceller la lamelle, appliquez la solution de vaseline fondue le long de son périmètre à l’aide d’un pinceau ou d’un cure-dent. Les cellules sont désormais prêtes à être observées. Lorsque vous placez la lame sur le microscope, assurez-vous que les deux polariseurs sont alignés perpendiculairement l’un par rapport à l’autre.

Veillez à ce que les filtres et les prismes soient hors du trajet de la lumière. Si le champ n’est pas sombre, faites tourner le polariseur situé sous le condenseur jusqu’à ce qu’il le devienne. Localisez les embryons à l’aide de l’objectif 10 fois.

Recherchez près des corps des vers des groupes d'embryons jeunes afin d'obtenir plusieurs embryons dans le champ d'imagerie. Évitez les embryons situés à l'intérieur du ver pour obtenir les meilleures images. Une fois les meilleurs embryons localisés, passez à un objectif de puissance plus élevée.

Remplacez maintenant le cube de filtre par celui de contraste de phase DIC. Ensuite, insérez le prisme walstone supérieur de l'objectif dans le trajet de lumière et faites tourner la bague du condenseur pour sélectionner le prisme walstone inférieur correspondant à l'objectif. Une fois les prismes en place, réglez le curseur situé sous cette tourelle afin qu'il corresponde à l'ouverture numérique de l'objectif.

Pour obtenir une illumination de Köhler optimale, focalisez le condenseur jusqu'à ce que le bord du diaphragme du condenseur apparaisse le plus net possible. Le point de netteté maximale correspond à un contour bien défini entre la lumière et le noir. Pour obtenir un contraste optimal, ajustez le mur d'entrée et le prisme en tournant le bouton du curseur.

Le microscope est maintenant presque prêt à être utilisé. Il est temps de régler les paramètres d'imagerie supplémentaires sur l'ordinateur à l'aide de Micro-Manager et d'un logiciel libre. Commencez par régler le gain de la caméra à zéro.

Ensuite, passez à l'enregistrement des fichiers en tant que TIFF 8 bits, et non 16 bits. Les fichiers TIFF peuvent ensuite être analysés à l'aide de logiciels libres tels qu'ImageJ. Ajustez ensuite le niveau de lumière de manière à ce que les pixels les plus brillants soient juste en dessous du seuil de saturation. Si toutes les étapes ont été correctement effectuées, l'image aura un aspect tridimensionnel, comme si la lumière provenait d'un angle oblique.

Maintenant que l'image est excellente, sélectionnez les embryons que vous souhaitez acquérir et dessinez une région d'intérêt. Si le microscope dispose d'un moteur de focalisation, utilisez-le pour collecter plusieurs plans focaux à chaque instant. Ouvrez la fenêtre d'acquisition multidimensionnelle et définissez les plans supérieur et inférieur de la pile Z en ajustant le bouton de mise au point afin de trouver le premier et le dernier plan focal où des granules de vitellus sont nets.

Définissez l'incrément de pas. Cela déterminera le nombre de plans focaux collectés. Réglez ensuite un intervalle de temps suffisamment long pour acquérir l'ensemble des plans focaux.

Les points temporels maximum peuvent être fixés très haut afin que le logiciel prenne des images jusqu'à ce qu'il soit arrêté manuellement. Configurez le logiciel pour qu'il affiche uniquement la dernière image acquise, afin de pouvoir surveiller le processus. Donnez maintenant un nom de fichier aux images et commencez l'acquisition des images.

L'analyse d'image sera brièvement revue à la fin de la section suivante. La réalisation d'un film GFP ressemble beaucoup à la création de quatre D ni Musky DIC, mais un fichier de configuration incluant la commande logicielle du disperseur de fluorescence est utilisé. Une fois les embryons localisés, assurez-vous que le prisme walstone supérieur n'est pas sur le trajet de la lumière et basculez le cube de filtres vers F-I-T-C-G-F-P.

Si ce paramètre n'a pas été automatiquement activé au démarrage à l'aide du logiciel, assurez-vous que le gain de la caméra est réglé sur 255. Un fichier image est défini au format tiff 16 bits. Éteignez maintenant la source de lumière transmise et cliquez sur l'acquisition d'images en direct.

Réglez l'intensité de la source de lumière UV et la durée d'exposition pour obtenir un bon rapport signal sur bruit pour le signal de fluorescence ; toutefois, maintenez l'exposition à la lumière au minimum afin de préserver les cellules. Ensuite, définissez l'intervalle de temps. Le nombre de points temporels et le nombre de plans focaux étant fixés, procédez à l'acquisition d'images comme décrit précédemment.

Pour analyser les films, utilisez un logiciel libre. ImageJ avec le greffon micromanager installé permet également d'importer des fichiers vidéo très volumineux dans ImageJ à l'aide du greffon loci. Cet embryon de type sauvage a été capturé en optique DIC sans masque.

La partie postérieure se trouve en bas à droite et la partie ventrale en bas à gauche. La vidéo montre une séquence d'images prises sur un plan focal unique, acquises toutes les 15 secondes. La lecture est réglée à 14 images par seconde.

Cet embryon exprime une fluorescence durant la première division embryonnaire, le pôle postérieur se trouvant en haut à droite. Ce film montre les changements observés dans un plan focal unique toutes les 10 secondes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d’imager des embryons vivants en utilisant à la fois l’optique DIC Naski et la fluorescence en épi-illumination pour étudier des événements dynamiques.

Nous espérons que vous avez maintenant une meilleure compréhension de la mise en place de l'optique DIC Nomars pour obtenir des images optimales, et que vous réalisez qu'il est possible d'obtenir des données fluorescentes de haute qualité à l'aide d'une illumination en fluorescence épi, sans dépendre systématiquement de microscopes plus sophistiqués. Vous pouvez également appliquer ces techniques d'imagerie à l'examen d'embryons dépourvus de la fonction d'un gène spécifique afin d'approfondir l'analyse des exigences génétiques liées aux phénomènes qui vous intéressent durant la division cellulaire ou le développement.