Configuration d'une nappe de lumière Microscope simple pour En Toto Imagerie de C. elegans Développement
5 mai 2014
Ce protocole décrit la configuration d'une feuille microscope optique et sa mise en œuvre pour l'imagerie in vivo de C. elegans embryons.
L’objectif global de cette procédure est d’imager le développement de C Allergan à l’aide de la microscopie à feuillet de lumière à fluorescence. Pour ce faire, il suffit d’abord de mettre en place le microscope à feuillet de lumière composé d’un microscope vertical et d’un petit ensemble d’éléments optomécaniques pour générer un feuillet de lumière. La deuxième étape de la procédure consiste à monter l’embryon.
Les dernières étapes consistent à ajuster la feuille de lumière sur l’embryon et à enregistrer son développement. Les résultats permettent de montrer la dynamique des protéines marquées par fluorescence au cours du développement de CL egan via l’analyse de vidéos 3D et time lapse. Le principal avantage de la microscopie à faisceau léger par rapport à d’autres méthodes existantes, telles que la microscopie confocale, est qu’elle permet une imagerie plus rapide avec une phototoxicité plus faible.
Troisièmement, cette méthode peut donner un aperçu de l’étanchéité contre le développement. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que le roil ou le poisson zèbre. La démonstration de la procédure sera claire.
Shales un ingénieur de mon laboratoire et Pauline Linac, une ingénieure du laboratoire de van. Cette section décrit l’assemblage de la configuration, et il peut être laissé assemblé pour toutes les expériences. Une fois que les lasers, les filtres, le télescope et le périscope ont tous été positionnés sur la table optique, fixez la lentille cylindrique pour générer la feuille de lumière.
Un objectif différent est ajusté pour la mise au point. Le foyer de l’objectif d’éclairage doit coïncider avec le point focal de l’objet de l’objectif de détection. Maintenant, projetez le faisceau sur le mur ou l’écran et déplacez l’objectif d’éclairage le long de l’axe du faisceau jusqu’à ce que les contours de la projection soient nets.
Incluez un filtre d’émission à quatre lignes et une caméra E-M-C-C-D dans la configuration du microscope. Fixez la deuxième étape de translation manuelle à la première de manière perpendiculaire. Vissez l’ensemble sur la platine de microscope existante.
Après avoir retiré l’objectif d’éclairage à lentille cylindrique réglé, positionnez l’ensemble sur le microscope et remettez le réglage d’éclairage sur les platines. Fixez le support qve à l’intersection perpendiculaire de la trajectoire d’éclairage et de la trajectoire de détection. Maintenant, vérifiez la feuille de lumière.
Remplissez un verre de solution de fluorescéine et placez-le dans le support sur les platines. La feuille de lumière doit être visible. Il doit être horizontal et centré par rapport à l’objectif de détection.
Ensuite, retirez la lentille cylindrique. Optimisez la feuille de lumière avec la traduction 3D de l’objectif d’éclairage, et acquérez une image pour mesurer l’épaisseur de la feuille de lumière. Cela dépend de l’ouverture de l’objectif.
Assurez-vous ensuite de remplacer la lentille cylindrique. Tout d’abord, coupez un morceau de verre d’un millimètre d’épaisseur, 10 millimètres sur 20 millimètres. Utilisez un marqueur diamant.
Ensuite, ajoutez 20 microlitres de poly L lysine d’un côté et, une fois sec, juxtaposez-le à une deuxième lame. Dans une position fixe, ajoutez une goutte de 5 % d’agar et lissez-la avec le poids d’une troisième glissière posée sur le dessus. Une fois que la gélose a séché, retirez la troisième lame et coupez le tampon gélosé à trois millimètres du bord des deux lames restantes sur la lame sans poly L lysine.
Retirez ensuite la lame fixe en laissant un surplomb d’agar. Enduisez l’agar de 20 microlitres de poly L lysine et laissez-le sécher. Placez maintenant des vers GR dans un verre de montre rempli de milieu M nine sous un microscope de dissection.
Coupez les vers avec un scalpel au niveau de la vulve, libérant ainsi les œufs. Identifiez ensuite les embryons qui sont du stade d’intérêt et collectez-les à l’aide d’une micropipette capillaire. Transférez les embryons sur le surplomb de gélose de la lame préparée juste à côté du bord de la lame, et non sur le bord de la gélose.
Alignez ensuite les embryons à l’aide d’une micro pipette capillaire tout en retirant le liquide. Par aspiration, les embryons vont adhérer au polyol lysine. Il est très important de bien positionner les embryons pour obtenir un bon enregistrement, et cela nécessite un capillaire avec la bonne apture.
S’ils sont trop petits, il sera difficile de libérer les embryons. S’il est trop grand, il sera difficile de contrôler étroitement le flux qui s’échappe et d’aligner les embryons, de couvrir la lame avec du milieu M neuf dans une boîte de Pétri et de confirmer que les embryons sont toujours attachés à la gélose à l’aide d’un grossissement. Maintenant, fixez la lame préparée avec des embryons au porte-échantillon qui s’adapte à un vétérinaire.
Le support est un engin fabriqué en interne qui est conçu pour s’adapter à un vétérinaire. Ensuite, fixez le vétérinaire à un étage électrique Pizo et, sous un éclairage en fond clair, localisez un embryon. Démarrez maintenant le progiciel de contrôle de l’optique acoustique accordable.
Filtrez la caméra et la scène. Ce logiciel a été écrit en interne, mais le logiciel gratuit micromanager peut également être utilisé. Tout d’abord, sélectionnez la ligne laser.
Ensuite, ajustez la platine le long de l’axe des x jusqu’à ce que la feuille de lumière soit à son plus brillant. Ajustez ensuite les deux autres dimensions, Y et Z, jusqu’à ce que le rapport signal/bruit soit à son meilleur. Il peut être nécessaire de répéter cette opération pour chaque embryon.
Cette clé permet d’optimiser le rapport signal/rapport pour obtenir un bon enregistrement traduisant le d’un stade libre, le soutien de l’objectif et l’élimination lorsque je n’ai qu’une relation pour obtenir une simulation globale de l’embryon et le meilleur contraste. Maintenant, acquérez des images en accéléré, réglez la puissance d’exposition laser, le gain de temps et l’intervalle d’imagerie en fonction du niveau de fluorescence de l’embryon et de la vitesse du processus biologique analysé. Pour Zack.
L’imagerie définit la distance entre les coupes et leurs positions de début et de fin dans c elgan exprimant une construction GFP d’histones. Une imagerie time-lapse de deux heures a été réalisée avec 20 piles de tranches prises toutes les 37 secondes. Les divisions cellulaires étaient clairement visibles chez une souche exprimant la tubuline fusionnée à la GFP et sa pierre fusionnée à la cerisier. Les enregistrements ont été pris pendant 16 minutes toutes les 105 secondes.
Les rendus 3D sont affichés à trois moments chronologiques. Les fuseaux mitotiques et les chromosomes condensés sont clairement visibles et facilement suivis à travers les divisions cellulaires. Dans une troisième souche, la lipoprotéine APO vit two fusionnée à la GFP a été imagée avec le marquage mCherry de la membrane cellulaire.
Pendant 13 minutes, 10 piles de tranches ont été prises toutes les 27 secondes. Les particules de lipoprotéines se déplaçant rapidement étaient faciles à suivre. Ici, nous utilisons la feuille légère formée par des méthodes plus complexes pour produire.
La feuille de lumière pourrait être mise en œuvre pour améliorer encore la résolution spatiale.
Aperçu
Ce protocole décrit la mise en place d'un microscope à feuillet lumineux et son utilisation pour l'imagerie in vivo d'embryons de C. elegans. La méthode permet une imagerie plus rapide avec une phototoxicité réduite par rapport à la microscopie confocale.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biophysique
- Microscopie
Contexte
- La microscopie à feuillet lumineux offre une approche unique pour l'imagerie d'échantillons biologiques.
- Cette technique est particulièrement utile pour l'observation d'embryons vivants.
- Elle minimise les dommages phototoxiques tout en permettant une imagerie rapide.
- Les applications s'étendent à divers organismes modèles autres que C. elegans.
Objectif de l'étude
- Visualiser le développement des embryons de C. elegans à l'aide de la microscopie à feuillet lumineux en fluorescence.
- Analyser la dynamique des protéines marquées par fluorescence au cours du développement.
- Mettre en évidence les avantages de la microscopie à feuillet lumineux par rapport aux méthodes traditionnelles.
Méthodes utilisées
- Installation d'un microscope à feuillet lumineux avec des éléments optomécaniques.
- Montage d'embryons sur des lames préparées munies de tampons en agar.
- Optimisation de l'alignement du feuillet lumineux pour l'acquisition d'images.
- Acquisition d'images en lapse de temps pour capturer les processus de développement.
Résultats principaux
- Imagerie réussie des divisions cellulaires et de la dynamique des protéines dans les embryons de C. elegans.
- Des reconstructions 3D des fuseaux mitotiques et des chromosomes ont été obtenues.
- Démonstration de la capacité à suivre des protéines en mouvement rapide.
- A permis d'obtenir des informations sur les processus de développement de l'organisme.
Conclusions
- La microscopie à feuillet lumineux est un outil puissant pour l'imagerie in vivo.
- Cette méthode améliore la compréhension du développement embryonnaire.
- Elle peut être adaptée pour être utilisée avec d'autres organismes modèles.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La microscopie à feuillet lumineux permet une imagerie à haute résolution et faible phototoxicité du développement d'organismes entiers, soutenant la validation de cibles en phase de découverte précoce grâce à des données phénotypiques dynamiques et quantitatives. Cette approche réduit l'incertitude biologique dans les modèles précliniques en permettant le suivi longitudinal des processus cellulaires et de la dynamique des protéines dans des systèmes vivants. La méthode améliore la confiance prédictive dans l'identification de composés candidats en fournissant des résultats d'imagerie reproductibles et évolutifs, compatibles avec des flux de travail de criblage à contenu élevé.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à une visualisation à résolution subcellulaire des dynamiques protéiques et des divisions cellulaires dans les embryons en développement.
- Valeur opérationnelle : Soutient la détection biologique des risques en fournissant des mesures reproductibles et quantitatives des phénotypes développementaux dans des conditions de faible phototoxicité.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles en générant des jeux de données longitudinaux et multiparamétriques qui corréleront les perturbations moléculaires aux résultats du développement.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit une imagerie en 3D et en temps réel normalisée avec une résolution subcellulaire, permettant une évaluation fiable des effets des composés dans un contexte d'organisme entier.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité des tests grâce à un alignement et une stabilisation précis des feuilles de lumière, réduisant ainsi la variabilité lors des séances d'imagerie longitudinales.
- Extensibilité : Compatible avec des chambres d'observation multipuits et une commande automatisée de la platine, prenant en charge des campagnes de criblage à débit moyen.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Fait le lien entre la découverte et la validation préclinique en permettant une évaluation phénotypique cohérente à travers différents systèmes modèles grâce à des protocoles d'imagerie standardisés.
- Déminimisation des risques mécanistiques : Permet l'observation directe des effets de l'interaction avec la cible sur les processus de développement, réduisant ainsi l'ambiguïté dans les études sur le mécanisme d'action.
- Progression ajustée au risque : Fournit des seuils quantitatifs pour les décisions d'avancement ou d'arrêt basées sur des métriques de toxicité développementale et de normalisation phénotypique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'optimisation des candidats, offrant une modalité d'imagerie quantitative non destructive pour le criblage phénotypique et les études mécanistiques dans des modèles d'organismes entiers.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en permettant le suivi en temps réel de protéines marquées par fluorescence et de structures cellulaires au cours de l'embryogenèse.
- Écrans (screening) : Assure la préparation des tests grâce à des protocoles standardisés de préparation des lames, de caractérisation du feuillet lumineux et de montage des embryons, garantissant une cohérence dans l'imagerie.
- Analytique : Produit des données quantitatives en 3D et en laps de temps (par exemple, dynamique du fuseau mitotique, trafic des protéines) permettant des comparaisons objectives entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la continuité préclinique en fournissant des données phénotypiques pertinentes pour les maladies chez C. elegans, un modèle validé pour les voies développementales conservées.
- Réutilisation en milieu professionnel : Conçu comme un système modulaire assemblé sur une table optique, permettant une utilisation répétée dans divers projets avec un recalibrage minimal.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à l'observation directe et longitudinale de la dynamique des protéines et du comportement cellulaire.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité grâce à des procédures standardisées d'alignement optomécanique, de préparation des lames et de montage des embryons.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en permettant une détection précoce de la toxicité développementale, réduisant ainsi l'abandon en phase tardive dû à des risques biologiques non identifiés.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque en fournissant des scores phénotypiques quantitatifs, basés sur l'imagerie, qui éclairent les décisions d'avancement à travers différentes classes de cibles.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en alignement optique, en microscopie à fluorescence et en préparation d'échantillons pour l'imagerie en direct.
- Exige une table optique stable, des sources laser, des objectifs, des plateaux motorisés et une caméra EM-CCD ou sCMOS pour la détection.
- Implique une standardisation interéquipes de la préparation des lames, du stade des embryons et des paramètres d'imagerie afin d'assurer la reproductibilité entre utilisateurs et sites.
- Les considérations d'adaptation incluent la taille de l'embryon, le clarification optique et la compatibilité du milieu de montage lors de l'extension à d'autres systèmes modèles (par exemple, le poisson zèbre, Drosophila).
- Les limitations pratiques comprennent l'efficacité de l'immobilisation des embryons et l'uniformité du feuillet lumineux sur de grands champs de vision, ce qui peut nécessiter une optimisation pour des séances d'imagerie prolongées.
