ampliPHOX détection colorimétrique sur un microréseau d'ADN pour la grippe

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser une nouvelle méthode rapide d'amplification de signal pour détecter et caractériser des sous-types viraux de la grippe sur la puce à grippe, une plateforme de microarray de faible densité. Cela est réalisé en incorporant des DTP biotinylés et en utilisant des amorces portant une extrémité 5' phosphorylée afin d'amplifier le segment du gène matriciel et un segment du gène non structuré à partir d'extraits d'ARN de la grippe. La PCR est suivie d'une digestion enzymatique et d'une fragmentation pour générer un produit viral amplifié, simple brin et biotinylé, qui est ensuite hybridé sur la matrice après hybridation.

La détection Fox utilise la photopolymérisation pour faire croître de grandes taches polymériques là où a lieu l'hybridation, et les profils d'hybridation différentielle permettent de détecter les sous-types viraux de la grippe. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la détection classique par fluorescence, est qu'elle est relativement peu coûteuse et fournit un résultat rapide, visible à l'œil nu, avec une sensibilité analytique comparable à celle de la fluorescence. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la caractérisation des virus grippaux à l'aide de la puce à grippe, car il s'agit d'une méthode de détection universelle.

Ampl Fox peut également être appliqué à une grande variété d'autres systèmes, tels que d'autres puces à ADN ou protéines à faible densité. En théorie, tout produit biotinylé devrait pouvoir être détecté à l'aide d'amox. La procédure sera démontrée par Amber Taylor, scientifique associée, et Kevin Moulton, assistant de recherche, tous deux travaillant chez Endeavor et ayant joué un rôle central dans le développement de l'instrument Fox et de la chimie de détection au cours des dernières années.

Extraire l'ARN viral à partir de 200 microlitres d'isolat viral en utilisant un kit d'extraction d'ARN viral et le protocole du fabricant. Eluer un volume final de 60 microlitres et conserver les extraits à moins 70 degrés Celsius ou à une température inférieure pour une utilisation ultérieure. Ensuite, préparer le mélange maître de R-T-P-C-R sur glace selon le protocole du fabricant.

À l'aide d'un mélange de dNTP BIOTINYLÉS, ajouter le mélange d'amorces flu chip, contenant les concentrations indiquées, au mélange maître. Une amorce de chaque jeu doit porter un groupe phosphorothioate en position cinq prime afin de faciliter la digestion enzymatique. Le jeu d'amorces flu A produit un produit de 1032 paires de bases, et le jeu d'amorces flu B produit un produit de 811 paires de bases.

Vortexez brièvement et répartissez 18 microlitres de mélange maître dans des tubes PCR à paroi mince. Ajoutez ensuite 2 microlitres de matrice d'ARN à chaque tube de réaction. Placez les tubes PCR dans un thermocycleur et utilisez un profil de cyclage avec une température d'hybridation appropriée.

Le profil de cyclage utilisé dans ce dosage est indiqué ici. Préparez le mélange de digestion enzymatique en combinant 2,2 microlitres de tampon réactionnel pour enzyme, 0,8 microlitre d'eau sans nucléase et 1,0 microlitre d'enzyme lambda exonucléase par réaction PCR. Retirez les échantillons du thermocycleur et ajoutez quatre microlitres à chaque tube PCR.

Replacer les échantillons dans le thermocycleur et programmer le thermocycleur à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, suivis de 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, appliquer des puits d'hybridation à usage unique autour des puces à ADN à hybridation. Puis laver les lames dans 110 millilitres d'eau purifiée sur un agitateur orbital pendant cinq minutes.

Séchez les lames en touchant doucement le bord du puits avec un essuie-tout. Combinez 22 microlitres de tampon d'hybridation 2x avec chacun des produits d'ADN simple brin fragmentés, mélangez brièvement et pipetez 40 microlitres dans les puits de la matrice. Laissez les lames s'hybrider pendant une heure dans une chambre d'humidité ; après l'hybridation, retirez les lames de la chambre d'humidité et rincez brièvement chaque lame avec deux millilitres de tampon de lavage D. Placez les lames dans un support à lames.

Ensuite, ajoutez 110 millilitres des tampons de lavage A et B dans des récipients séparés à l’aide d’un agitateur orbital. Lavez le porte-lame dans le tampon A à 60 à 90 tr/min, vitesse utilisée pour tous les lavages ultérieurs, pendant une minute. Retirez ensuite le porte-lame du tampon de lavage A et rincez brièvement avec le tampon de lavage D. Transférez le porte-lame dans le tampon de lavage B et lavez-le sur l’agitateur orbital pendant cinq minutes.

Après le lavage, séchez délicatement les puces sur chaque lame avec un essuie-tout et placez les lames séchées dans la chambre d'humidité. En prévision des étapes de détection métrique à quatre couleurs, mélangez 10 microlitres d'amplificateur, 20 microlitres de tampon amplificateur 2 x et 10 microlitres d'eau purifiée pour chaque puce à traiter, transférez 40 microlitres du mélange de marquage sur chaque puce et laissez la réaction de marquage se dérouler dans une chambre d'humidité fermée pendant cinq minutes. Pendant l'hybridation, préparez 110 millilitres de tampon de lavage C dans un récipient. Après le marquage, rincez immédiatement chaque puce avec le tampon de lavage D. Placez chaque lame dans le porte-lames et effectuez un lavage avec le tampon de lavage C sur un agitateur orbital pendant cinq minutes ; après le lavage au tampon C, immergez brièvement le porte-lames trois fois dans un récipient contenant de l'eau purifiée.

Pour éliminer les résidus de sel, séchez les puces comme indiqué précédemment. Conservez les puces dans une boîte à diapositives sombre jusqu'à l'activation photochimique et l'acquisition d'images, qui doivent être réalisées dans les 24 heures. Ensuite, allumez le lecteur Amli Fox et assurez-vous que le logiciel Amli View est prêt pour l'activation photochimique avant la détection des échantillons de puces.

Tout d'abord, déterminer le temps optimal d'activation lumineuse pour tous les échantillons en suivant une courte procédure d'étalonnage. Une fois par jour d'utilisation, porter la solution Amplify à température ambiante et vortexer brièvement pour homogénéiser ; pipeter trois microlitres d'activateur Amplify dans le flacon Amplify et vortexer soigneusement. Appliquer uniformément pendant 10 secondes 40 microlitres de solution Amplify sur une seule lame à la fois, en veillant à ce qu'aucune bulle ne soit présente.

Insérez la lame de puces à ADN dans la baie de photoactivation du lecteur Amplify. Démarrez la photoactivation en sélectionnant « démarrer » dans le logiciel de vue PL, en utilisant le temps de photoactivation déterminé lors du processus d'étalonnage. Une fois l'opération terminée, rincez la micropuce avec deux millilitres d'eau purifiée afin d'éliminer l'excès de polymère Amplify Clear. La formation de polymère est désormais survenue sur les taches contenant l'ADN cible, mais elle est mieux visualisée.

Après la coloration, laissez sécher les taches de polymère pendant deux minutes. Ensuite, appliquez deux gouttes d'amplex red sur la matrice et laissez la coloration se poursuivre pendant deux minutes. Après la coloration, rincez rapidement la lame avec de l'eau purifiée et faites-la sécher comme indiqué précédemment. Insérez la lame dans la chambre d'imagerie du lecteur Amli Fox pour acquérir une image, en utilisant le logiciel amli pour traiter les résultats. L'image de gauche montre la détection d'un échantillon du virus H1N1 nouveau en 2009 par le système Amli Fox.

Bien que l'image de droite utilise la fluorescence traditionnelle générée par un scanner microarray à fluorescence confocale, le même motif global de détection est facilement observable pour les deux méthodes. Toutefois, le résultat Amli fox est visible à l'œil nu. Ces images montrent les résultats du flu chip provenant d'une origine humaine, H3N2 d'origine humaine, H1N1, d'origine porcine, H1N1, et d'une matrice fox négative sans influenza détectable.

Les séquences deux et trois encadrées en bleu produisent un signal pour tous les sous-types de la grippe A indiqués, mais les séquences encadrées en rouge en bas à droite ne produisent un signal que pour l'échantillon d'origine porcine H1N1. L'échantillon négatif montre un signal sur une séquence témoin interne encadrée en vert, indiquant l'absence d'inhibition ou d'échec de la réaction RT-PCR.

Une fois maîtrisé, l'ensemble du processus, de l'extraction en flacon jusqu'à la détection de l'amoxicilline et l'interprétation du résultat final, peut être réalisé en environ six heures. La partie détection Ampl Fox de la procédure, y compris l'étalonnage de l'appareil, peut être accomplie en environ 30 minutes en suivant cette méthode. D'autres techniques, telles que le séquençage partiel ou complet du génome, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires.

Cet essai de grippe est conçu comme un dépistage initial, en particulier pour les échantillons produisant un profil d'hybridation unique. Étant donné que la détection constitue un essai général, nous espérons que les chercheurs découvriront de nouvelles applications intéressantes des puces à ADN à faible densité auxquelles la détection pourrait apporter une valeur ajoutée.