Fabrication puce microfluidique et méthode pour la détection de la grippe

L’objectif global de l’expérience suivante est de détecter le virus de la grippe A à l’aide d’une puce microfluidique. Tout d’abord, faites passer l’échantillon avec le tampon de lyse à travers le canal SPE pour lycer le virus et extraire l’ARN, chargez le réactif R-T-P-C-R avec l’ARN extrait et exécutez le canal de transcription inverse pour convertir l’ARN viral en ADNC. Ensuite, faites passer le mélange dans le canal PCR afin d’amplifier les résultats d’ADN obtenus qui montrent la taille et la concentration de l’amplicon en fonction du signal de fluorescence de l’électrophorèse capillaire.

Le principal avantage de cette technologie est qu’elle accepte l’échantillon brut du patient et qu’elle intègre l’extraction des acides nucléiques, la purification, la transcription inverse et l’amplification dans une seule puce Pour créer deux plaques, répartissez uniformément environ neuf grammes de pastilles XN X au centre d’une plaque métallique, placez-les sur une presse chauffée à 198 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, appliquez lentement une pression à 2 500 PSI pendant encore cinq minutes. Maintenant, placez une plaque sur le moule époxy, préchauffez à 157 degrés Celsius pendant 10 minutes et appliquez lentement une pression à 1000 PSI pendant 10 minutes supplémentaires.

Ensuite, en portant des gants thermiques, retirez la plaque et le moule de la presse à chaud, puis retirez la plaque du moule avant qu’il ne refroidisse. Percez trois trous dans la puce en relief, un à l’entrée, un à l’orifice de déchets et un à la sortie du canal microfluidique. Ensuite, lavez les chips avec de l’IPA suivi des ARN et de l’eau de dianna.

Séchez les copeaux à l’air pour les lier, préchauffez d’abord à 131 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis appuyez à 350 PSI pendant 10 minutes supplémentaires. À l’aide de JB Weld Epoxy, fixez des nano-orifices à l’entrée des déchets et aux orifices de sortie et durcissez séparément pendant 15 à 24 heures. Selon les instructions du fabricant, rincez le canal SPE avec 50 microlitres d’ARN suivi de 100 microlitres d’eau sans nucléases.

Chargez maintenant le canal SPE avec quatre microlitres de solution de greffe fraîchement préparée pour réticuler le méthacrylate incuber pendant 10 minutes dans un four UV, retirez la solution de greffe résiduelle avec un vide. Cassez la pastille de microsphère séchée en tapotant sur le tube avec le couvercle fermé. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution de colonne SPE fraîchement préparée et un vortex pour mélanger.

Chargez quatre microlitres de la solution SPE dans le même canal de réticulation par irradiation UV pendant 2,5 minutes de chaque côté, ce qui permet d’obtenir une colonne SPE polymérisée blanche opaque. Lavez le canal avec 500 microlitres de 100 % de méthanol pour rincer l’excès de réactifs et les solvants pyrogènes intra-polymères. Fixez deux couches minces chauffantes au bas de la puce à l’aide d’un ruban thermoconducteur.

Notez que les côtés des éléments chauffants doivent être alignés avec le bord des canaux larges pour la durée dénée et qu’en s’agenouillant séparément, placez cinq thermocouples dans la puce à travers les canaux latéraux ouverts sans issue de chaque bande de puce. Pour fixer l’emplacement des thermocouples, ajoutez quatre microlitres de 25 XRNA secure à 96 microlitres d’éthanol à 70 % dans un tube et à 100 % d’éthanol dans un deuxième tube. Préparez également 300 microlitres de tampon de canal et 316 microlitres de tampon de lyse.

Chauffez les solutions à 60 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pour activer l’ARN sécuriser, puis pour équilibrer le canal microfluidique. Faites passer le tampon de canal à travers le canal SPE à un débit de 0,8 millilitre par heure.

Maintenant, échantillon de test de fava rapide en VTM à 37 degrés Celsius. Retirez l’échantillon dès qu’il est décongelé. Centrifugez l’échantillon à 13 000 tr/min pendant 10 minutes.

Transférez 100 microlitres de surnageant dans 300 microlitres de tampon de lyse, et ajoutez six microlitres d’un microgramme par support de microlitre, vortex d’ARN à mélanger. Ensuite, tournez pendant cinq secondes et chargez tout le lysat dans un verrou de leurre, une seringue CC. Faites passer le lysat dans le canal SPE à un débit de 0,8 millilitre par heure.

Ensuite, lavez le canal SPE avec 100 microlitres d’éthanol à 70 %, puis 100 microlitres d’éthanol à raison d’un millilitre par heure. Positionnez une seringue vide à la marque de 0,5 millilitre et poussez l’air à travers le canal pour la sécher à un millilitre par heure. Maintenant, faites couler 67,5 microlitres d’eau sans nucléases dans le canal pour éluer les acides nucléiques liés à 0,5 millilitre par heure et collectez 13,5 microlitres du port nano au port de déchets.

Chargez 36,5 microlitres du maître R-T-P-C-R. Mélangez dans le port nano au niveau de l’orifice de déchets et mélangez avec de l’ARN matrice pour une réaction R-T-P-C-R de 50 microlitres. Chargez ensuite le mélange R-T-P-C-R dans le canal RT par un vide doux.

Scellez le port nano avec un raccord fermé. Appliquez 35 volts au premier appareil de chauffage. Conservez les réactifs dans le canal RT pendant 30 minutes après l’équilibre du premier appareil de chauffage à 50 degrés Celsius.

Conservez les réactifs dans le canal RT pendant 15 minutes après l’équilibre du premier appareil de chauffage à 95 degrés Celsius. Ensuite, appliquez 27 volts au radiateur un et 50 volts au radiateur, deux pour équilibrer le radiateur, un à 60 degrés Celsius et le radiateur deux à 95 degrés Celsius. Poussez les réactifs dans le canal PCR à 0,5 microlitre par minute.

Environ 20 minutes plus tard, lorsque les réactifs approchent de la fin du canal serpentin, collectez les produits PCR à la sortie à l’aide d’un pipeteur de taille appropriée et d’une pointe pour le test ADN à haute sensibilité Agilent. Retirez le kit d’ADN haute sensibilité Agilent du réfrigérateur 30 minutes avant le test. Allumez le bioanalyseur et ouvrez le logiciel expert 2, 100.

Chargez un microlitre de produits PCR pour le test et suivez le protocole Agilent. Analysez et enregistrez les données dans ce flux de travail. L’échantillon nasal pharyngé du patient est mélangé à un tampon de lyse et appliqué sur la puce.

La puce est exécutée et les produits PCR du virus de la grippe sont rouges à l’aide d’une puce d’électrophorèse capillaire commerciale. En raison des différentes quantités de virus de la grippe dans l’échantillon de chaque patient, la concentration finale du produit PCR varie. Un bon résultat doit avoir un faible bruit pour éliminer les pics d’échelle à 35 et 10, 380 paires de bases et un pic de produit unique à la taille de produit conçue de 107 paires de bases pour l’échantillon positif.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication et de l’utilisation de la puce de micro-fluide pour détecter le virus de la grippe A.