PGS élastomère échafaudages en génie tissulaire artérielle

Ce vidéo montre comment fabriquer des échafaudages tubulaires poreux et les soumettre à un conditionnement mécanique dynamique pour l'ingénierie tissulaire artérielle. Cette procédure est réalisée en fabriquant d'abord les échafaudages à l'aide d'un élastomère biodégradable et d'une méthode de fusion par assaut. Les échafaudages sont ensuite préparés pour la semence cellulaire et assemblés dans un système de bioréacteur.

Dans le bioréacteur, des cellules musculaires lisses vasculaires sont ensemencées sur les supports et cultivées. Quelques semaines plus tard, le tissu est récolté et analysé par microscopie électronique à balayage, coloration hématoxyline-éosine et autofluorescence de l'élastine. Le muscle lisse obtenu est à la fois multicouche et orienté perpendiculairement.

L'avantage principal de cette technique, similaire au blanchiment particulat, consiste à utiliser un moule en verre pour fabriquer une structure tubulaire poreuse à base d'acide hyaluronique. Une fois le moule retiré, le moule de support est préparé à partir d'un morceau de tube en verre. Placez le tube dans un support et versez la solution d'acide hyaluronique préparée la veille dans le tube.

L'acide hyaluronique s'écoule lentement le long de la paroi intérieure. Lorsqu'il atteint le fond du moule, retournez le moule. Répétez cette étape jusqu'à ce que la paroi intérieure du moule soit uniformément recouverte par la solution.

Après le revêtement, sécher tous les moules en verre préparés dans une étuve sous vide à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Habituellement, quatre moules sont préparés simultanément pendant que les moules en verre sèchent. Préparer les versements de particules de sel, broyer et tamiser les particules de sel à une taille de 25 à 32 micromètres.

Le lendemain, assemblez le mandrin en verre préparé, le tube en PTFE, la gaine thermorétractable et l'anneau en PTFE. Commencez par insérer le mandrin dans des morceaux de tube en PTFE de 65 millimètres de longueur et faites-les cuire à 120 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pendant que le PTFE rétrécit, préchauffez un incubateur d'hybridation à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes.

Une fois que le tube a entouré les mandrins, faites glisser le manchon thermorétractable sur le mandrin afin qu'il puisse se déplacer librement. Ensuite, placez le mandrin à l'intérieur du moule en verre et fixez l'anneau A-P-T-F-E au bas du mandrin. Vérifiez que l'anneau en PTFE est bien ajusté au fond du moule en verre.

Ensuite, à l’aide d’une spatule et d’un entonnoir en caoutchouc de silicone, ajoutez les bouillies de particules de sel dans le moule en verre. Tapez ensuite doucement sur le moule avec la spatule pour assurer une répartition uniforme des particules et retirez l’excès de sel. Éteignez maintenant l’incubateur chauffé et chargez-le rapidement avec les moules remplis de sel ; la fusion du sel s’effectuera au cours des 30 minutes suivantes, après quoi séchez les moules dans une étuve sous vide à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Le lendemain, après refroidissement, retirez le mandrin en acier inoxydable des moules en le poussant vers l'extérieur tout en maintenant la bague en PTFE. Si nécessaire, utilisez une pince brucelles. Ensuite, retirez la bague en PTFE de la base du moule.

Ensuite, faites chauffer les moules pour rétracter la gaine et retirez les gaines rétractées des moules. Laissez les moules refroidir jusqu'à leur utilisation et stockez-les dans un dessiccateur sous hotte. À l’aide d’une pipette, inclinez les moules en verre à 45 degrés et déposez goutte à goutte la solution de PGS dans leur lumière interne tout en tournant lentement le moule.

Vérifiez si la solution de PGS s'écoule le long de la paroi du moule. S'il y a un endroit sec, ajoutez davantage de PGS. Laissez ensuite l'ÉT s'évaporer sous la hotte pendant au moins 30 minutes. Une fois l'ÉT évaporé, durcissez les moules dans une étuve sous vide.

Après un durcissement de vingt-quatre heures, refroidir les moules à température ambiante et les plonger lentement, verticalement, dans de l'eau déionisée à 24 degrés Celsius. Les incliner trop rapidement crée des bulles d'air, qui déchirent la structure. Transférer soigneusement les moules dans le bain d'eau.

Positionnez-les en biais à l'aide d'un tube en silicone et laissez l'acide hyaluronique se dissoudre pendant une heure. Si, après une heure, l'acide hyaluronique n'est pas libéré du moule, utilisez alors une spatule, le moule étant toujours immergé, pour repousser lentement l'acide hyaluronique depuis les deux extrémités, puis secouez doucement le moule. Vérifiez à présent que les supports n'ont pas bougé à l'intérieur du moule en verre ; le cas échéant, tirez lentement sur le support à l'aide de pinces pour le libérer du moule.

Ensuite, éliminer les particules de sel en transférant soigneusement les échafaudages délicats dans un bain d'eau déionisée sous agitation douce. Cette étape prendra au moins trois jours et nécessite un changement d'eau quotidien. Une fois que tout le sel a été éliminé, transférer chaque échafaudage dans un tube centrifuge de 15 millilitres rempli d'eau déionisée et les congeler pendant une heure dans une boîte à glace sèche. Placer les tubes centrifuges congelés dans un lyophilisateur pendant trois jours, avec les bouchons ouverts.

Une fois lyophilisés, conserver les échafaudages dans un dessiccateur jusqu'à leur utilisation. Commencer par découper les échafaudages en morceaux de 25 à 30 millimètres de longueur. Ensuite, préparer deux bouchons en caoutchouc de silicone en faisant passer un tube en téflon (PTFE) à travers les trous centraux de chaque bouchon.

Ensuite, découpez des segments de 1,5 millimètre de longueur dans l'anneau HS et faites glisser un segment à une extrémité du support. Insérez un tube en PTFE fixé au bouchon dans la même extrémité du support, avec un recouvrement suffisant pour se situer sous l'anneau HS afin de relier fermement le support au tube, rétractez l'anneau HS dans un four, puis laissez l'ensemble refroidir à température ambiante. Ensuite, un tube en polycarbonate de 50 millimètres, qui sert de chambre de bioréacteur, est glissé par-dessus le support et fixé à la surface intérieure du bouchon en caoutchouc de silicone.

Comme précédemment, un autre tube en PTFE et un bouchon sont fixés à l'autre extrémité du support à l'aide d'un anneau hs afin de compléter la chambre. Le second bouchon est attaché à l'autre extrémité du tube en polycarbonate. Ensuite, les surfaces extérieures des bouchons sont fixées à deux plaques en alliage d'aluminium.

Insérez deux tiges filetées dans le trou latéral de chaque plaque et fixez les plaques avec des vis à bouton. Fixez l'échafaudage au bioréacteur. Mesurez ensuite la longueur visible de chaque échafaudage, correspondant à la distance entre les deux anneaux hs, puis calculez leurs surfaces internes.

Pour la mise en place des cellules. Dans un autoclave, stériliser les chambres, chacune enveloppée individuellement dans du papier d’aluminium, ainsi que chaque composant de l’unité de bioréacteur. Une fois stérilisés, assembler le bioréacteur à l’intérieur d’une hotte de culture cellulaire.

Prétraitez et rincez le support à l'aide d'une série de perfusions en utilisant une pompe péristaltique à un millimètre par minute dans le circuit de flux. Commencez par rincer avec de l'éthanol à 70 %, de l'éthanol à 50 %, puis de l'éthanol à 25 %, pendant une heure chacun. Après ces trois rinçages à l'éthanol, effectuez un rinçage au PBS pendant deux heures.

Enfin, perfuser le bioréacteur avec le milieu de culture des CML pendant 24 heures, après quoi il est prêt pour l'ensemencement cellulaire et les expériences. Ensuite, suivre les instructions du manuscrit accompagnant pour ensemencer le bioréacteur avec 2 millions de cellules par centimètre carré et, au cours des 21 jours suivants, changer le milieu dans les tubulures et ajuster la vitesse de la pompe. Progressivement, la pression dans le constructus augmentera d'environ quatre millimètres de mercure le premier jour de culture à plus de 100 millimètres de mercure après deux semaines de culture ; après trois semaines de culture, récolter les cellules et les préparer pour analyse selon les indications du manuscrit accompagnant.

Ces échafaudages tubulaires en PGS ont été fabriqués par la méthode de fusion du sel. Des micrographies électroniques par balayage ont démontré que tous les échafaudages présentaient des épaisseurs de paroi homogènes et qu'aucun défaut partiel n'était présent au niveau de leurs sections transversales. Des macropores et micropores répartis aléatoirement ont été observés sur la surface luminaire de tous les échafaudages.

Après la culture cellulaire, les SMC multilaminaires se sont développés avec une orientation perpendiculaire à la direction du flux. En outre, les cellules et les protéines de DCM ont complètement recouvert la lumière de toutes les structures en PGS. L'autofluorescence de l'élastine a également révélé des fibres élastiques organisées de manière circonférentielle à la surface luminaire de la structure.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez comprendre comment fabriquer un échafaudage tubulaire poreux, observer les cellules et cultiver l'échafaudage à l'aide d'un bioréacteur préconçu.