Le façonnage d'une bicouche Hydrogel de contrôler la différenciation ASC

L'objectif général de cette procédure est de créer une matrice composite à base de biomatériaux naturels pouvant être utilisée pour délivrer et différencier des cellules souches afin de favoriser la cicatrisation des plaies. Cela est réalisé en isolant d'abord des cellules souches dérivées du tissu adipeux, ou aSC, à partir d'un animal de test. Ensuite, les aSC sont chargées sur des microsphères de chitosane préfabriquées.

Ensuite, un gel de collagène fibrillé est coulé, et les billes A-S-C-C-S-M sont disposées en couche sur le gel de collagène. Enfin, un gel de fibrine PEG est coulé par-dessus le gel de collagène A-S-C-C-S-M, puis du milieu est ajouté. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant la migration simultanée bidirectionnelle des A SC depuis la bille CSM vers les matrices de collagène et de fibrine PEG.

Grâce à cette procédure, une seule source de cellules souches peut recevoir des signaux différentiels provenant des microenvironnements de collagène et de fibrine PEG, et être différentiellement stimulée pour produire des facteurs pléiotropes et former un réseau de structures prévasculaires. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les composites à matériau unique ou les substituts cutanés décellularisés, est que ces autres produits n'assurent pas activement la révascularisation du produit par l'organisme hôte. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons observé que le RAD A SE isolé a tendance à s'orienter vers un phénotype vasculaire lorsqu'il est cultivé dans une matrice de fibrine porcine.

Cette observation a suscité l'idée qu'une source unique de cellules souches pourrait être utilisée simultanément dans un système composé de différents biomatériaux. Après avoir isolé et cultivé des cellules souches dérivées du tissu adipeux ou ASC, préparé des microsphères de chitosane ou CSM et chargé les ASC dans les CSM, préparez un hydrogel de fibrine et de polyéthylène glycol en dissolvant le PEG modifié par le succinyl glutarate dans quatre millilitres de solution saline tamponnée au Tris. Juste avant l'expérience, stérilisez la solution à l'aide d'un filtre de 0,22 micron.

Dans un puits de culture d'une plaque à six puits, mélanger 500 microlitres de solution mère de fibrinogène et 250 microlitres de solution mère de PEG, puis incuber pendant 20 minutes dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Ensuite, mélanger 250 microlitres de A-S-C-C-S-M préparé précédemment avec la solution de fibrinogène greffée au PEG, ajouter immédiatement un millilitre de solution mère de thrombine et, à l’aide d’une pipette, tri-ralentir rapidement une ou deux fois, puis placer immédiatement le mélange de gel cellulaire dans une plaque à 12 puits et incuber dans une enceinte humidifiée à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Par la suite, laver deux fois le fibrinogène greffé au PEG obtenu avec du HBSS et incuber avec le milieu minimal essentiel alpha complété par 10 % de FBS dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius, en utilisant des techniques standard de microscopie en lumière pendant une période de 11 jours.

Observer la migration des cellules du CSM vers le mélange de gel, A-S-C-C-S-M, contenant du collagène de type I extrait des tendons de queue de rat à l'aide de deux hydroxydes de sodium normaux. Ajuster le pH à 6,8 et provoquer la fibrillation. Ajouter le collagène fibrillé, le mélange A-S-C-C-S-M, dans une plaque de 12 puits et incuber dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après avoir vérifié que la fibrillation est complète, incuber les gels de collagène A-S-C-C-S-M jusqu'à 11 jours dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Observer la migration des cellules depuis le CSM vers le gel au cours d'une période de 11 jours à l'aide de techniques de microscopie standard afin de développer le construct bicouche pour étudier les propriétés migratoires et de co-induction d'une source unique de cellules souches. En utilisant deux échafaudages biologiques.

Préparez les gels de collagène et de fibrine PEG avec les légères modifications suivantes : préparez un millilitre de collagène à 7,5 milligrammes par millilitre. Transférez ensuite le mélange dans un insert de culture tissulaire à six puits et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après une fibrillation complète, déposez sur la surface du collagène 200 microlitres de cinq milligrammes de A-S-C-C-S-M dans le milieu de culture.

Une fois que les microsphères se sont déposées sur le gel, préparez le gel de fibrine PEG à l’aide de 250 microlitres de milieu de culture cellulaire. Ensuite, superposez la solution de fibrinogène pegylé et de thrombine sur les couches de collagène A-S-C-C-S-M. Une fois cette étape terminée, incubez les assemblages pendant 30 minutes dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone afin d’obtenir une réticulation complète.

Enfin, ajoutez un millilitre de milieu dans la chambre supérieure au-dessus du construct et trois millilitres de milieu dans la chambre inférieure. La caractérisation d'une SC intégrée dans cet échafaudage a révélé qu'une CSM chargée de SC peut être placée en sandwich entre une couche de collagène et une couche de fibrine PEG, et recevoir simultanément et différemment des signaux provenant des deux environnements extracellulaires afin de prospérer dans leurs nouvelles conditions. Comme illustré ici, le collagène soutient la capacité des ASC à rester des cellules souches, comme le montre leur expression de stro-1 en vert, ainsi que leur morphologie de type fibroblastique.

En revanche, le fibrine PEG a induit chez les ASC une différenciation vers un phénotype avasculaire, comme le montre leur morphologie en forme de tube ici présentée, complète avec lumière, ainsi que leur expression spécifique de cellules endothéliales du facteur de von Willebrand, illustré ici en rouge. De plus, comme le démontre cette observation, ces phénotypes apparaissent précocement en culture et sont maintenus pendant 11 jours. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode d'isolement des cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de rat, de leur chargement sur des microsphères de chitosane, puis de leur incorporation dans un hydrogel bicouche à l’aide de biomatériaux approuvés par la FDA.

N'oubliez pas que les biomatériaux et les cellules utilisés dans ce protocole proviennent d'animaux et d'êtres humains et peuvent être extrêmement dangereux s'ils sont contaminés par des agents pathogènes provenant de leur hôte. Des précautions telles que l'utilisation d'équipements de protection individuelle et de techniques aseptiques de culture cellulaire doivent toujours être prises lors de l'exécution de ces procédures.