Un dispositif microfluidique Dégradé génératrices de biologie cellulaire

Je m'appelle Jiang. Je suis chercheur postdoctoral à Harvard et au MIT, au sein du programme Sciences et technologie de la santé. Et je m'appelle Amir Manchi, et je suis étudiant de premier cycle au laboratoire du professeur Ha SANE, à Harvard, au sein de la division des Sciences et technologies de la santé du MIT.

Cette diapositive montre le schéma du processus permettant de fabriquer le dispositif : on effectue d'abord un dépôt par centrifugation de SUA 50 sur la vapeur de silicium, puis on place un masque au-dessus de la vapeur de silicium, suivi d'une exposition UV et d'un développement. On peut finalement obtenir et positionner ces plots sur la vapeur de silicium. Ensuite, on coule simplement le PDMS, puis on procède au démoulage et à la cuisson, et on perce de petits trous ; on peut alors réaliser l'assemblage par collage entre le dispositif en PDMS et une lame de verre à l'aide d'un plasma d'oxygène.

Très bien, nous sommes maintenant dans la salle de microfabrication située à l'intérieur du laboratoire, et nous allons commencer par fabriquer des couches de PDMS. Par PDMS, j'entends le terme scientifique précisément polyméthylsiloxyane, un polymère organique. Il s'agit du polymère organique à base de silicium le plus largement utilisé.

Il s'agit en réalité d'un mélange de deux composants différents : une base d'élastomère de silicone et un agent de réticulation pour élastomère de silicone. Le ratio est donc de 10 parties de base pour 1 partie d'agent de réticulation. Nous avons besoin d'environ 10 grammes de base et, en conséquence, d'environ 1 gramme d'agent de réticulation pour élastomère, que je vais maintenant mélanger intimement avec la base.

J'utiliserai des pipettes. Maintenant que le mélange est prêt, je vais effectivement le verser sur le wafer de silicium. L'idée est que ces wafers de silicium présentent des motifs à leur surface.

Ils aident en réalité ce polymère PDMS à obtenir le motif souhaité, et nous utilisons ces motifs afin de créer des canaux, des rainures ou tout autre motif nécessaire sur ces polymères. L'étape suivante consiste à placer le mélange sous vide pour éliminer les nombreuses bulles présentes dans ce mélange. Je vais placer les gels de PDMS sur la tranche de silicium à l'intérieur de la chambre à vide.

Je vais fermer la chambre et ouvrir le vide. Une fois les bulles disparues, après environ quelques minutes, nous allons placer l'ensemble dans l'étuve pendant toute la nuit, à environ 70 degrés Celsius, ce qui permettra aux échantillons de se solidifier. Le motif sur lequel je veux que vous portiez votre attention comprend ces trois chambres de réservation différentes, destinées à créer des gradients, de sorte que nous ayons une concentration nulle d'un côté et une concentration spécifique de l'autre côté, avec une progression uniforme vers cette dernière. Nous réaliserons ensuite une petite perforation à l'extrémité opposée, qui servira de sortie dans ce cas précis.

L'étape suivante consiste à découper l'un de ces motifs et à le transférer dans une boîte de Pétri, en orientant les surfaces du motif vers le haut. J'espère que vous pouvez voir les trois entrées et la sortie unique que je vous ai expliquées sur ces motifs. Nous utiliserons de petites perforatrices pour nos entrées afin de pouvoir utiliser des tubulures en polyéthylène, et j'utiliserai des perforatrices plus grandes pour ma sortie afin d'obtenir une réserve d'eau.

Nous allons donc commencer par la première entrée. Je vais faire une perforation, la même chose avec la deuxième et également une petite perforation pour la troisième. La toute dernière étape consiste à faire une grande perforation à la sortie.

Une fois terminé, nous avons la couche A-P-D-M-S, qui est la couche supérieure, et je vais utiliser une autre couche de verre en dessous. Ces lames microscopiques constitueront ma couche inférieure pour les dispositifs microfoliques. Nous sommes maintenant dans la salle de microfabrication et je dispose d'une couche de verre et d'une couche de PDMS que je souhaite assembler ensemble.

Ce que nous allons utiliser maintenant est une machine appelée nettoyeur à plasma. Ce qui va se produire à l'intérieur de la chambre, c'est que le plasma aidera à rompre l'équilibre superficiel faible et à le remplacer par des groupes chimiques hautement réactifs, et la surface deviendra en réalité hydrophile. Ce qui va se passer maintenant, c'est que je vais prendre le moule en PDMS, qui constituait la couche supérieure et comportait des canaux à l'intérieur, puis j'enlèverai le ruban que j'avais placé auparavant afin d'empêcher la poussière de s'attacher à notre moule.

Je vais le placer à l'intérieur de la chambre. La prochaine étape consiste à utiliser une couche de verre, qui est une lame de microscope, et cette lame constituera notre couche inférieure à l'intérieur du dispositif. Je vais donc placer celle-ci également à l'intérieur de la chambre.

Et je ferme complètement la chambre une fois qu'elle est fermée, d'abord l'alimentation, puis la pompe, et ensuite nous devons revenir à cette machine dans environ cinq minutes. Ce que je vais faire, c'est éteindre la machine. J'éteins donc d'abord la pompe, puis l'alimentation, et j'ouvrirai la chambre.

Ce son est en réalité dû à la pression négative appliquée pendant le processus à l'intérieur de la chambre. Je vais donc retirer les différentes couches et je souhaite les assembler ensemble. Puisque le verre constitue la couche inférieure, je le tiendrai dans ma main gauche en le maintenant fixe, puis je prendrai la couche en PDMS et la placerai au-dessus de la couche de verre.

Mais puisque les motifs sont actuellement orientés vers le haut, je vais inverser la couche de PDMS. Je la place sur le verre après les avoir pressés ensemble. Ils s’attachent très facilement, et l’un des avantages de ce traitement au plasma est la force d’adhérence et la permanence.

Voilà à quoi cela ressemble à la fin. Encore une fois, ce sont nos entrées et voici ma sortie, et nous sommes prêts à passer à l'étape suivante. Faire cuire la fibre à l'intérieur du dispositif, puis placer dans l'incubateur pendant une heure, puis prélever un échantillon SIM de l'incubateur après une heure, puis ajouter la nourriture pour culture de poisson, puis préparer la solution.

Pour préparer la solution d'EGF, nous ajoutons simplement deux millilitres de milieu de culture dans la partie Azure, puis nous y ajoutons 15 nanogrammes par millilitre d'EGF et 10 micromolaires de 50 D ; cette solution permet de visualiser difficilement le gradient d'EGF à travers le canal. Ensuite, nous prélevons deux millilitres de milieu, du milieu virtuel, et nous ajoutons ici deux autres millilitres de milieu. Ces deux compartiments contiennent uniquement des cultures normales, une perfusion de culture normale dans le dispositif.

Donc, j'élimine la bulle, je reconnecte à nouveau, celle-ci est également une bulle mobile M qui redescend. Ensuite, j'utilise simplement 15 nanogrammes d'EGF et 10 micromoles de fi dextrane, ainsi que deux mils de milieu provenant du prélèvement, que je mets dans la seringue, puis vous savez, la bulle. Ensuite, il suffit de commuter la solution, puis de revenir en arrière.

La solution est aspirée dans la seringue à gaz, puis appuyez plusieurs fois sur SH pour éliminer les bulles. Ensuite, dirigez d'abord toute la solution des seringues vers le raccord, puis actionnez le levier afin que la solution traverse le raccord en T, puis le tube, et sorte par l'extrémité du tube. Une fois le mélange effectué et la solution en sortie, insérez simplement le tube dans l'appareil My Predict. Les trois solutions sont alors identiques. Vous pouvez alors raccorder délicatement l'entrée du canal d'infusion.

Donc, finalement, deux correspondent à des milieux de culture normaux. L'un est un milieu de culture avec EGF, afin de confirmer le profil de gradient d'EGF. Celui-ci est la cellule en réseau, cellule en réseau.

Cela permettra la sortie des cellules, créant ainsi un gradient à l’aide du canal à trois jonctions, puis générant le gradient à l’intérieur de la zone cellulaire. Normalement, ce que je souhaite faire, c’est simplement effectuer l’ensemencement cellulaire, suspendre les cellules, les diriger vers la sortie, puis appliquer doucement une aspiration pour que les cellules circulent dans la zone cellulaire, où elles s’installent automatiquement et s’attachent en se déposant sur le revêtement, en veillant à ce qu’elles s’étalent complètement. Une fois que l’on s’est assuré que les cellules sont totalement étalées, on peut alors commencer l’infusion et étudier la migration cellulaire à l’aide du dispositif générant le gradient.