Un dispositif microfluidique pour l'étude de plusieurs souches distinctes

L'objectif général de la méthode suivante est d'observer le comportement de cellules individuelles provenant de différentes souches de levures dans des conditions dynamiques identiques. Cela est réalisé en fabriquant un dispositif microfluidique à deux couches, où la couche inférieure contiendra séparément chacune des différentes souches, et la couche supérieure permettra d'appliquer les conditions d'écoulement dynamique dans une deuxième étape. Différentes souches de levures sont placées dans les puits, puis le dispositif est fermé, créant un canal unique contenant plusieurs souches séparées.

Ensuite, nous observons les réponses cellulaires à des changements dynamiques du milieu. En contrôlant les débits aux deux entrées du canal en Y, les résultats montrent différentes souches soumises aux mêmes conditions dynamiques, sans contamination croisée entre les puits. Ce dispositif microfluidique présente plusieurs avantages clés par rapport aux autres systèmes existants. Il permet d'observer plusieurs souches distinctes sous les mêmes conditions dynamiques.

Également, et surtout, il peut être fabriqué facilement dans n'importe quel laboratoire sans nécessiter d'équipement particulier. L'origine de cette méthode découle d'une discussion sur la manière de suivre les réponses de différents isolats sauvages d'East aux passages de privation. Commencez par dessiner ou imprimer le tracé souhaité des microcanaux à l'échelle.

Ensuite, recouvrez une lame de verre de couches de ruban adhésif transparent. Pour obtenir la hauteur souhaitée du canal, placez le modèle de conception sur une surface plane et alignez la lame par-dessus le motif de conception. Découpez maintenant soigneusement le ruban adhésif sur la lame de verre selon le modèle. Retirez le ruban adhésif de toutes les régions de la lame de verre.

Acceptez ceux-ci dans la disposition du microcanal. Placez la lame dans une étuve chauffante à 65 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, nettoyez délicatement avec de l'éthanol.

Mélangez les composants de base et de durcissement du PDMS conformément aux recommandations du fabricant. Versez environ 30 millilitres du mélange de PDMS dans une boîte de Pétri jusqu'à une hauteur d'environ 0,5 centimètre. Dégazez le PDMS sous vide si nécessaire.

Immergez la lame de verre dans le PDMS avec le ruban adhésif structuré orienté vers le haut. Placer le motif après le PDMS empêche la formation de bulles d'air entre la lame et le fond de la boîte. Durcissez pendant 48 heures à 65 degrés Celsius, en veillant à ce que la boîte soit horizontale à l'aide d'un niveau à bulle, dans une nouvelle boîte de Pétri de 90 millimètres. Versez trois millilitres de mélange de PDMS.

Cette étape peut être réalisée sur un spin codeur si disponible. DGAs et polymérisation comme indiqué précédemment. Découpez maintenant délicatement la couche d'écoulement du dispositif microfluidique à la taille souhaitée à l'aide d'un poinçon biopsique.

Créez des trous pour les entrées et sorties dans la couche d'écoulement. Découpez également une couche de puits de taille similaire à partir du deuxième plat de Pétri et placez-la sur un verre épais. Faites glisser le gabarit par-dessus la disposition du design.

Ensuite, percer des puits en les alignant avec les microcanaux de la configuration à l'aide d'éthanol, nettoyer les deux couches de PDMS et une lame de verre, puis les faire sécher à l'air. Puis, traiter la lame de verre et la couche de PDMS des puits soit avec un graveur à plasma standard pour une liaison non réversible, soit avec un appareil à décharge coronale portatif pour une liaison réversible. Placer soigneusement la couche des puits au-dessus de la lame afin d'assurer l'adhésion.

Éliminer délicatement toutes les bulles d'air. Préparer le milieu souhaité dans des seringues adaptées et les relier à un tube tigon passé dans une pompe à seringue. Pour l'imagerie cellulaire.

Utilisez les forces. Rendez-vous à la phase souhaitée, vortexez soigneusement la culture et transférez 300 microlitres dans des tubes de microcentrifugation. Déposez délicatement un microlitre de con canna A dans chaque puits de la couche de puits en PDMS.

Éliminer l'excès de conna A de chaque puits deux fois en pipetant délicatement de l'eau pendant que le con en A sèche. Laver les souches deux fois avec 300 microlitres de milieu SC dépourvu de glucose. Éliminer le glucose résiduel des parois cellulaires favorise une bonne adhérence au conval.

Après vortexage, pipeter soigneusement environ 0,5 microlitre de la suspension cellulaire dans chaque puits individuel. Rincer doucement les cellules résiduelles avec du milieu riche. Les deux prochaines étapes doivent être réalisées rapidement afin d'éviter que les cellules ne s'assèchent.

Étape facultative : traitez le chip et les puits en prenant soin de ne pas toucher directement les puits. Ensuite, sous un stéréomicroscope, placez délicatement le chip sur les puits en portant une attention particulière à l'alignement entre les deux. Appuyez doucement pour faire adhérer les deux couches de PDMS.

Remplissez lentement complètement le dispositif avec environ 50 microlitres de milieu riche, en veillant à ce qu'aucune bulle d'air ne reste à l'intérieur du canal. Connectez maintenant le dispositif en insérant les tubes dans les entrées appropriées et démarrez l'écoulement du milieu. Veillez à ce qu'aucune bulle d'air ne se forme dans les tubulures, car celles-ci peuvent s'obstruer dans le dispositif et perturber l'écoulement.

Procédez au placement du dispositif sous un microscope et repérez des points d'imagerie appropriés dans chacun. Maintenez les cellules sous un flux abondant de milieu pendant une heure ou plus, si nécessaire, afin de permettre la récupération.

Démarrez l'expérience avec un débit constant. Réglez la pompe A à 0,8 millilitre par heure et la pompe B à 0,2 millilitre par heure. Pour un milieu s'écoulant sur 80 % de la largeur du canal.

Nous pouvons modifier dynamiquement les conditions dans le dispositif en changeant les débits relatifs. Les nouvelles conditions se stabilisent en quelques secondes sur toute la longueur du canal. Pour démontrer la séparation entre différentes souches, deux souches de levure distinctes sont imagées dans des puits alternés.

Remarquez qu'il n'y a pas de fuite cellulaire entre les puits lors de cette expérience. Les deux souches possèdent le facteur de transcription MSN deux marqué avec YFP afin de tester l'effet simultané de conditions changeant dynamiquement. Les débits dans les deux canaux d'entrée ont été modifiés pour créer un palier avec un milieu sans glucose.

Cela a entraîné la localisation de MSN deux dans le noyau. Importamment, la courbe temporelle des niveaux de MSN deux-YFP nucléaire peut être analysée dans des cellules individuelles. Ainsi, le dispositif microfluidique en PDMS peut être utilisé pour appliquer simultanément des conditions dynamiques à plusieurs puits.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas laisser les cellules sécher pendant l'assemblage du dispositif. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée facilement sans nécessiter de lithographie douce.