Préparation, la purification et la caractérisation des complexes de lanthanides pour utilisation comme agents de contraste pour imagerie par résonance magnétique

L'objectif général de cette procédure est de synthétiser, purifier et caractériser des complexes contenant des lanthanides pouvant être utilisés pour marquer des macromolécules biologiques. Cela est réalisé en mélangeant d'abord le matériau de départ métallique et le ligand tout en contrôlant le pH de la solution. La deuxième étape de la procédure consiste à purifier le complexe obtenu par dialyse.

Ensuite, il convient de vérifier l'absence de métal libre. La dernière étape de la procédure consiste à caractériser les propriétés du complexe pertinentes pour l'imagerie. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent que les complexes synthétisés se comporteront comme des agents de contraste grâce à des mesures d'activité de relaxation.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'imagerie, comme de savoir si le nombre de coordination de l'eau d'un agent de contraste change lors de sa liaison à une protéine. En général, les personnes ayant besoin de cette méthode éprouveront des difficultés, car un contrôle insuffisant du pH rendra l'IL inutilisable pour l'enseignement biologique. La démonstration de la dialyse et des mesures d'activité sera assurée par Buda et Sashi.

Les étudiants diplômés de mon laboratoire Pour commencer la méthylation à l'aide de sels de lanthanide, dissoudre d'abord un équivalent de ligand dans l'eau afin d'obtenir une solution de 30 à 265 millimolaire. Le ligand Paraiso Benzyl DTPA est utilisé ici à une concentration de 73 millimolaire. Ensuite, ajuster le pH de la solution de ligand entre 5,5 et 7 en ajoutant de l'hydroxyde d'ammonium à 1 molaire.

Dans cette vidéo, 0,2 millilitre de la solution d'hydroxyde d'ammonium un molaire est utilisé pour dissoudre un à deux équivalents de chlorure de lanthanide dans l'eau afin de produire une solution ayant une concentration de cinq à 1000 millimolaires. On peut utiliser soit le chlorure d'europium, soit le chlorure de gadolinium à des concentrations de 111 millimolaires. On utilise souvent un excès de métal pour pousser la réaction à complétion et, par conséquent, simplifier la purification.

Ensuite, ajoutez chaque solution de sels de lanthane à la solution préparée de ligand sous agitation. Ajustez maintenant le pH des mélanges réactionnels obtenus entre 5,5 et sept en ajoutant de l'hydroxyde d'ammonium 0,2 molaire. Ici, un volume total de 0,5 millilitre de la solution d'hydroxyde d'ammonium 0,2 molaire est utilisé pour ajuster la solution.

Si le ligand utilisé contient des groupes fonctionnels sensibles à l'acide, ajustez le pH plusieurs fois au cours de cette étape. Veillez à faire preuve de prudence lors de l'ajustement du pH, car si la solution devient trop basique, les groupes fonctionnels sensibles à la base, comme l'isothiocyanate, deviendront inutilisables. Pour la conjugaison, surveillez attentivement la réaction à l'aide de mesures de pH.

La réaction est terminée lorsque le pH reste constant. Pour les ligands ne contenant aucun groupe fonctionnel sensible à la base, une purification impliquant une augmentation du pH peut également être utile. Pour commencer la purification par dialyse, déterminez une longueur appropriée de tube de dialyse permettant de contenir le volume d'échantillon, plus une longueur supplémentaire pour contenir un volume additionnel équivalent à 10 % du volume d'échantillon. Suivez ensuite les instructions du fabricant pour couper le tube à cette longueur.

Dans cette vidéo, une membrane avec une coupure de poids moléculaire comprise entre 100 et 500 Dalton a été utilisée, mais des tubulures présentant une coupure à poids moléculaire plus élevée peuvent être utilisées selon les besoins, si cela est approprié, en fonction des recommandations du fabricant. Faites tremper la tubulure de dialyse découpée dans l’eau pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, remplissez un réservoir de dialyse avec de l’eau, qui servira de dialysat. Un bécher d’un litre est utilisé ici.

Le volume du dialysat doit être d'environ 100 fois celui de l'échantillon. Replier maintenant une extrémité du tube deux fois et fixer la partie repliée avec la pince de fermeture pour dialyse. Enrouler l'extrémité de la pince avec un élastique afin de garantir qu'elle reste fermée pendant la dialyse.

Filtrer le mélange réactionnel préparé précédemment à travers un filtre de 0,2 micron. Ensuite, charger le filtrat dans l'extrémité ouverte du tube, en prenant soin de ne pas déchirer le tube.

Veillez à laisser suffisamment d'espace libre pour fermer le tube. Repliez deux fois l'extrémité restante du tube, puis fixez-la avec un fermoir et enroulez le fermoir avec un élastique. Ensuite, attachez un petit flacon en verre contenant de l'air au niveau du serre-joint situé à une extrémité du tube de dialyse à l'aide d'un autre élastique.

Ensuite, fixez un flacon contenant du sable à l'autre pince. Ces flacons garantissent que le tube reste immergé dans le dialysat. Placez maintenant le tube complet dans le réservoir de dialyse contenant le dialysat.

Agiter le dialysat à l’aide d’un agitateur magnétique à faible vitesse à température ambiante. Veiller à ce que la vitesse d’agitation reste lente et que la solution ne forme pas de vortex. Changer le dialysat trois fois au cours d’une journée.

Dans cette vidéo, le dialysat est changé aux moments 2,5, 6,5 et 11,5 heures. Poursuivre la dialyse toute la nuit pendant un temps total de 20 à 28 heures. Une fois la dialyse terminée, retirer le tube du dialysat et ouvrir soigneusement une extrémité scellée pour prélever l'échantillon.

Lavez le tube de dialyse trois fois à l'eau et rassemblez les lavages avec l'échantillon. Enfin, éliminez l'eau de l'échantillon sous pression réduite ici. Ceci est réalisé par lyophilisation.

L'échantillon est congelé, puis placé sur un appareil de lyophilisation. Pour évaluer la présence de métal libre dans l'échantillon, préparez d'abord un tampon acétate en dissolvant 1,4 millilitre d'acide acétique dans 400 millilitres d'eau, ajustez le pH à 5,8 à l'aide d'hydroxyde d'ammonium un molaire, puis ajoutez de l'eau jusqu'à un volume total de 500 millilitres. Ensuite, dissolvez 0,3 milligramme de chaque complexe dans 0,3 millilitre de tampon.

Préparez maintenant l'indicateur xol orange, qui doit être à 16 micromolaire dans le tampon pH 5,8. Ajoutez trois millilitres de cette solution indicatrice aux complexes métalliques précédemment dissous. Détectez la présence de métal libre par l'observation d'un changement de couleur de l'indicateur, passant du jaune au violet.

Si désiré, la quantité de métal libre peut être quantifiée en établissant une courbe d'étalonnage. Si du métal libre subsiste, l'échantillon doit être davantage purifié par dialyse ou chromatographie liquide à haute performance avant sa caractérisation. Ensuite, pour déterminer le nombre de coordination à l'eau d'un échantillon d'opium, préparez une solution d'environ un millimolaire du complexe contenant l'opium dans l'eau, puis une autre solution de même concentration dans l'oxyde de deutérium.

Avant l'analyse, la solution d'oxyde de deutérium doit être évaporée et redissoute trois fois dans de l'oxyde de deutérium afin d'éliminer l'eau résiduelle, allumez le spectrofluorimètre, ajoutez la solution aqueuse dans une cuvette propre et placez la cuvette dans le spectrofluorimètre. Effectuez ensuite les excitations et émissions pour déterminer les maxima respectivement à environ 395 nanomètres et 595 nanomètres. Ensuite, réalisez une expérience de décroissance temporelle de la phosphorescence en utilisant les longueurs d'onde d'excitation et d'émission précédemment déterminées ainsi que les paramètres affichés ici.

Répétez cette étape avec une solution préparée d'oxyde de deutérium. À partir des données de décroissance de la luminescence obtenues, tracez le logarithme naturel de l'intensité en fonction du temps. La pente de ces droites correspond aux taux de décroissance. Dans cette vidéo, Microsoft Excel 2007 a été utilisé pour générer les courbes du logarithme naturel à partir des données brutes.

Utilisez les taux de décroissance dans l'équation élaborée par Hors et ses collaborateurs, présentée ici. Si votre ligand contient des groupes OH ou NH coordonnés au métal, l'équation doit être modifiée avant utilisation. Pour déterminer les mesures de relaxation de l'échantillon, sélectionnez d'abord le mode d'application souhaité sur l'analyseur de temps de relaxation, soit T1 soit T2.

Ici, le réglage T un est sélectionné. Préparez ensuite une série d'échantillons contenant différentes concentrations du complexe contenant un lanthanide dans un solvant approprié. Ici, l'eau est utilisée comme solvant et des solutions de dix cinq deux 0,5, 1,25, 0,625 et zéro.

Des solutions millimolaires sont préparées. D'autres solvants ou tampons peuvent être utilisés, mais il est important d'utiliser le solvant comme blanc. Le volume final de l'échantillon dépend spécifiquement de l'instrument utilisé.

Placer un échantillon dans l'appareil et le laisser reposer pendant cinq minutes afin qu'il s'équilibre à la température de l'appareil, qui est de 37 degrés Celsius pour l'unité utilisée dans cette vidéo. Déterminer maintenant le temps de relaxation en unités de secondes en ajustant les paramètres du logiciel pour obtenir une courbe exponentielle lisse pour T un ou T deux. Répéter ceci pour tous les échantillons, y compris le témoin.

Maintenant, calculez l'inverse des valeurs mesurées de T1 ou T2 et tracez-les. Représentez ces valeurs en fonction de la concentration de lanthane, exprimée en millimolaire. Ajustez le graphique avec une droite. La pente de la droite ajustée correspond à l'activité de relaxation, notée R1 ou R2 pour T1 et T2 respectivement.

Ici, nous observons le schéma général de la médiation et de la purification. Ce schéma illustre la procédure générale de la méthylation et les raisons justifiant le choix de différentes voies de purification. Ici, nous voyons un exemple de courbe de décroissance de la luminescence dans laquelle le logarithme naturel de la décroissance est tracé en fonction du temps ; les pentes des droites obtenues à partir de courbes similaires pour des solutions d'eau et d'oxyde de deutérium sont utilisées avec l'équation un pour déterminer le nombre de coordination en eau des complexes contenant de l'opium.

Un exemple représentatif de mesures de vivacité peut être observé ici, la pente de la droite ajustée correspondant à la vivacité T1 de l'échantillon. En complément du nombre de coordination de l'eau et de la caractérisation de la vivacité décrits dans le protocole, il est également important de caractériser les produits finaux à l'aide de techniques chimiques classiques. L'identité du composé peut être déterminée par spectrométrie de masse ; des spectres de masse représentatifs, montrant les profils d'isotopes caractéristiques des complexes contenant du gadolinium et de l'opium, sont présentés ici.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que la spectroscopie ENDOR, la CPG et l'analyse élémentaire peuvent être réalisées afin de caractériser davantage les complexes obtenus. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de synthétiser, purifier et caractériser des complexes contenant des lanthanides, qui peuvent être utilisés pour marquer des macromolécules biologiques.