Production et purification des droits de INO80 remodelage de la chromatine Complexes et Subcomplexes

Le but de cette procédure est de générer et de purifier des versions de type sauvage et mutantes de la multi-sous-unité dans le complexe de remodelage de la chromatine oh 80. Ceci est accompli en isolant d’abord les noyaux des cellules exprimant l’épitope du drapeau marqué dans les protéines O 80 Dans la deuxième étape, des extraits nucléaires sont préparés, puis le type sauvage ou l’humain mutant dans les complexes de remodelage de la chromatine O 80 est purifié par chromatographie anti-drapeau aros. En fin de compte, les compositions sous-unitaires des complexes NO 80 purifiés peuvent être analysées par western blot ou coloration à l’argent.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon dont les sous-unités des complexes de remodelage de la chromatine MultiPro contribuent à leur activité globale. Cette méthode est conçue spécifiquement pour l’étude des versions sauvages et mutantes du complexe de remodelage de la chromatine NO 80, mais elle peut également être utilisée pour étudier d’autres complexes nucléaires multi-sous-unités. Comme le médiateur.

L’étape la plus critique de la procédure est l’étape de l’extraction nucléaire. Les gens rencontrent généralement des problèmes parce que pendant l’étape d’extraction du sel, les gens ont tendance à ajouter du sel trop rapidement ou trop vigoureusement Après la culture Dans des flacons roulants, transférez les cellules HEC 2 9 3 dans un tube conique gradué de taille appropriée et faites-les tourner pendant 10 minutes à 1000 fois G et quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le supinate, mesurez le volume de la pastille de cellule emballée, puis remettez la pastille en suspension dans cinq volumes de cellules de tampon A avec un pipetage doux et incubez les cellules sur de la glace pendant exactement 10 minutes.

Après avoir fait tourner à nouveau les cellules, mesurez la pastille cellulaire une deuxième fois, elle devrait avoir doublé de taille. Cette fois, mettez les cellules en suspension dans deux volumes cellulaires d’emballage du tampon A, puis transférez la suspension cellulaire dans un homogénéisateur de tissus de taille appropriée et homogénéisez la suspension cellulaire avec le pilon en verre lâche jusqu’à ce que 90 % des cellules se colorent positivement avec une centrifugeuse bleu trian, les cellules homogénéisées dans un tube de centrifugation à grande vitesse de 45 millilitres pendant 20 minutes à 25, 000 fois G et quatre degrés Celsius dans un rotor à angle fixe. Retirez ensuite le natant SUP contenant les protéines cytosoliques de la cuiller nucléaire pour extraire les noyaux avec du sel.

Ajoutez maintenant 2,5 millilitres de tampon C, mais tous les trois millilitres de volume de cellule de départ emballé à la pastille. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique, délogez la pastille de la paroi du tube et transférez l’ensemble du mélange dans un homogénéisateur de duvet de taille appropriée. Homogénéisez le mélange en deux coups d’un pilon lâche pour ressusciter les noyaux en suspension, puis transférez la fraction nucléaire nu en suspension dans un bécher réfrigéré d’une taille telle que la suspension remplira le bécher jusqu’à au moins 0,5 centimètre de profondeur.

Ensuite, calculez le volume de chlorure de sodium à cinq molaires nécessaire pour amener la solution à une concentration finale de chlorure de sodium de 0,42 molaire selon la formule suivante. Maintenant, ajoutez progressivement le volume calculé de solution saline goutte à goutte tout en fixant doucement la suspension avec une tige de verre sur de la glace pour augmenter la concentration en sel de la suspension jusqu’à ce que tout le chlorure de sodium ait été ajouté et que la solution devienne très visqueuse. Ensuite, transférez soigneusement la suspension visqueuse dans des tubes en polycarbonate de 70 millilitres dans un rotor TI de type 45 avec capuchon et utilisez un mutateur pour bercer lentement les tubes scellés à quatre degrés Celsius Après 30 minutes, ultracentrifugez les échantillons dans un rotor TI 45 pendant 30 minutes à 40 000 fois G et quatre degrés Celsius, et tirez l’extrait nucléaire contenant des surnageants dans un seul récipient en plastique.

Divisez ensuite la solution d’extraction nucléaire en aliquotes de taille pratique, congelez-les dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Pour préparer l’anti-drapeau aros à l’immunopurification, commencez par utiliser une pipette de 200 microlitres avec la pointe coupée pour transférer 200 microlitres sur une suspension de billes anti-drapeau à 50 % dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Transférez les billes prélavées dans un tube conique contenant 10 millilitres d’extrait nucléaire fraîchement décongelé avant les heures de quatre degrés Celsius avec rotation lente sur un rotateur de laboratoire, puis collectez les aros de drapeau par centrifugation pendant cinq minutes de 1000 fois G et quatre degrés Celsius.

Ensuite, lavez l’extrait de perle P dans 10 millilitres de poux, quatre tampons 50 pendant cinq minutes de quatre degrés Celsius avec un balancement doux sur un mutateur. Ensuite, après avoir essoré le mélange d’extrait de billes, réutilisez-le à nouveau. Suspendez la pastille dans 100 à 150 microlitres de poux frais quatre 50, transférez les billes dans un micro tube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Continuer à rincer le tube conique de 15 millilitres avec 100 à 150 quats de microlitres de Lysol 50 jusqu’à ce que toutes les billes aient été transférées dans le tube de micro-centrifugeuse. Après avoir fait tourner les billes dans une micro-centrifugeuse, lavez-les trois fois avec un millilitre de lys four 50 et une fois avec un millilitre de EB 100.Buffer. Ensuite, pour éluer les protéines liées, ajoutez 200 microlitres de tampon EB 100 contenant le peptide drapeau et incubez l’échantillon à quatre degrés Celsius sur un nutt.

Après une demi-heure, granulez les billes dans la micro-centrifugeuse que vous obtenez, puis transférez le NATANT SUP contenant le élué dans le complexe OAC C dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse. Après avoir répété l’éluat quatre fois de plus, passez l’éluat tiré à travers une colonne de rotation vide pour éliminer toutes les billes aérodynamiques résiduelles de la fraction protéique. Enfin, utilisez un dispositif d’ultrafiltration centrifuge avec une coupure de 50 000 poids moléculaire pour concentrer la fraction protéique mentionnée environ 10 fois.

Comme l’illustre cette figure, la pureté des complexes de NO 80 préparés à l’aide des sous-unités d’étiquette de drapeau indiquées, comme cela vient d’être démontré, peut être évaluée à l’aide de gels de polyacrylamide SDS colorés à l’argent. Toutes les protéines qui apparaissent dans cette voie de contrôle sont des contaminants qui se lient de manière non spécifique aux aéros de drapeau. Ces étiquettes indiquent les interdictions correspondant aux sous-unités de NO 80 testées, et celles-ci indiquent les mobilités des marqueurs de poids moléculaire.

La position du type sauvage NO 80 est indiquée par le carré noir, et les positions des mutants NO 80 sont indiquées par les cercles ouverts. Les voies séparées par la ligne noire sont des gels séparés. La composition des complexes peut être évaluée par le sternum à l’aide d’anticorps dirigés contre diverses sous-unités du NO 80.

par exemple. Voici les sous-unités du module de domaine terminal final, le module associé au centre Helicase et le module SNF deux ont été évalués. Une fois maîtrisée, cette technique peut être terminée en une journée, en commençant par la récolte des cellules et en terminant par la purification des complexes.

Cette technique permettra aux chercheurs de purifier des complexes multi-sous-unitaires et des sous-complexes pour les cellules de mammifères afin d’étudier leurs fonctions. Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une meilleure compréhension de la façon de purifier le remodelage de la chromatine et d’autres complexes protéiques multi-sous-unitaires à partir de cellules humaines ou d’autres lignées cellulaires de momentum.