ReAsH / Flash d'étiquetage et d'analyse d'images de protéines dans les cellules du capteur Tetracysteine

L'objectif général de cette procédure est de marquer les cellules exprimant une protéine étiquetée par une tétracystéine et une protéine fluorescente à l'aide des colorants flash ou ash, puis d'analyser quantitativement les résultats. Cette approche consiste d'abord à transfecter une lignée cellulaire d'intérêt avec un plasmide portant une protéine fluorescente ainsi que la protéine cible contenant une séquence tétracystéine. Ensuite, la protéine exprimée est marquée avec R ou flash, et les colorants liés de façon non spécifique sont éliminés par des lavages avec BAL, en vue de l'observation microscopique.

Ensuite, un microscope confocal est utilisé pour acquérir des images fluorescentes des cellules en utilisant les voies de fluorescence de ash ou de flash et de la protéine fluorescente. Enfin, les images sont analysées à l'aide d'ImageJ afin de quantifier la liaison de ash ou de flash à la protéine cible. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent le degré de liaison de ash ou de flash à la protéine cible dans les cellules, grâce à la corrélation entre la fluorescence de ash et celle de la protéine fluorescente.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la simple utilisation de la protéine cible marquée à la GFP, est qu'elle permet de suivre une seconde propriété de la protéine, telle qu'un changement conformationnel, en plus de sa localisation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la sous-structure et de la fonction des protéines, telles que les événements de localisation, les changements conformationnels et les événements de liaison à LI qui modifient la capacité du TAC à s'associer ou à interagir. Nous avons eu cette idée pour la première fois lorsque nous souhaitions évaluer la manière dont de petits agrégats submicroscopiques polymorphes de la mét-huntingtine se formaient dans les cellules.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'analyse des données sont difficiles à apprendre en raison de leur complexité technique. Les étapes une à trois seront réalisées par Yasmin Ranson, une assistante de recherche de notre laboratoire, qui démontrera l'analyse des données. L'étape quatre sera réalisée par Sevki GaN, un étudiant diplômé de notre laboratoire, utilisant des méthodes standard de culture cellulaire pour la lignée cellulaire d'intérêt et une lame d'imagerie de cellules vivantes prête pour la transfection.

Préparez une culture de cellules adhérentes et transfectez-les avec votre plasmide contenant le gène de la marque TC d'intérêt. Selon la méthode de transfection choisie, il est important d'inclure des contrôles positifs et négatifs afin d'évaluer l'ampleur de la liaison spécifique aux marques TC, ainsi que de détecter d'éventuelles fuites de fluorescence entre les canaux lors de l'acquisition d'images de microscopie confocale. Par conséquent, pour une analyse en deux couleurs, assurez-vous que des échantillons ont été préparés pour chaque couleur individuellement, soit la protéine fluorescente seule, soit, si possible, une protéine T ctech liée à une structure charnue ou vs.

Mais sans protéine fluorescente. Un à deux jours après la transfection, rincez délicatement les cellules avec 300 microlitres de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) préchauffée, préparez une solution HBSS fraîchement préchauffée contenant 10 micromolaire d'éthanedithiol ou EDT et 1 micromolaire de flash ou ash. Après avoir retiré la HBSS des cellules, remplacez-la délicatement par 300 microlitres du milieu ash et incubez exactement 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire.

D'après notre expérience, des temps d'incubation plus longs augmentent considérablement la fluorescence de fond. Aspirez délicatement la solution de marquage des cellules et remplacez-la par 300 microlitres de HBSS préchauffé contenant 250 micromolaire de deux trois dimère, capropropanol ou BAL, pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Éliminez la solution de lavage par aspiration douce et remplacez-la par 300 microlitres de HBSS préchauffé.

Après ce lavage, les cellules peuvent être fixées avec du paraformaldéhyde, bien que nous ayons constaté que cela augmente la fluorescence cynique non spécifique. Par conséquent, nous observons généralement les cellules vivantes à température ambiante. En outre, la fixation des cellules avant l'étiquetage empêche la liaison du colorant bial.

Pour commencer l'observation des cellules au microscope confocal, configurez les paramètres d'imagerie pour chaque fluorophore individuel et assurez-vous qu'il y a un transfert négligeable du signal entre les canaux. Ensuite, ajustez les réglages du photomultiplicateur de manière à ce que la fluorescence maximale dans l'échantillon n'entraîne pas de saturation du détecteur. Une fois les meilleurs paramètres d'imagerie déterminés, ne modifiez aucun d'entre eux entre les échantillons.

Utilisez une vitesse de balayage de 200 hertz, enregistrez quatre moyennes de ligne et réglez le diamètre du diaphragme à une unité de surface. Le diamètre du diaphragme peut être agrandi si le rapport signal sur bruit pose problème. Toutefois, cela peut entraîner une certaine perte de résolution d'image.

Acquérez les images confondues selon un format de 12 bits ou supérieur, si possible. Pour maximiser la qualité de l'analyse quantitative des données. Acquérez des images pour le canal de la protéine fluorescente ainsi que pour le canal du colorant BI arsenal pour tous les échantillons.

Pour analyser les données, utilisez le logiciel Image J avec les greffons suivants. Si vous utilisez une version d'Image J antérieure à la version 1.32 C, cliquez sur les options suivantes. Pour permettre l'ouverture simultanée de plusieurs images, modifiez les options d'entrée barre oblique sortie, puis cochez la case pour utiliser le sélecteur de fichiers j afin d'ouvrir barre oblique partager.

Cliquez sur OK. Ouvrez les images d'intérêt. Image J définira automatiquement les intensités maximales et minimales des pixels affichées à l'écran pour chaque image séparément, car différentes images auront des intensités de pixels différentes.

Cela signifie que les images affichées ne sont pas comparables telles qu'elles apparaissent. Pour garantir que les images ouvertes soient toutes à la même échelle, définissez physiquement les intensités de pixels supérieure et inférieure à afficher. Pour définir ces valeurs, choisissez l'image, puis ajustez la luminosité et le contraste.

Cliquez sur « set », définissez les valeurs minimale et maximale affichées. Ensuite, choisissez « propagate to all open images » et cliquez sur « okay ». Sinon, placez toutes les images d'un canal particulier ensemble dans un seul fichier ou une pile.

ImageJ ajustera alors automatiquement toutes les images à la même échelle. Pour ce faire, choisissez des images empilées, sélectionnez des images à empiler, saisissez un nom commun à chaque fichier et sélectionnez les titres utilisés comme étiquettes. Cliquez sur OK.

Convertir toutes les images ouvertes en 8 bits pour l'analyse. En choisissant le type d'image 8 bits, cela rééchelonnera la plage affichée dans un intervalle allant de zéro à 255. Il est important de ne pas enregistrer par-dessus le format original de 12 bits ou supérieur, car cela entraînerait une perte d'information.

Enregistrez une copie dans un nouveau dossier appelé eight bit converted en utilisant l'option « Enregistrer sous ». Une méthode permettant d'examiner l'ampleur de la liaison du colorant bi arsal dans une image complète consiste à réaliser un tracé de corrélation de l'intensité des pixels. Ce tracé représente la valeur de chaque pixel dans un canal par rapport à la valeur du pixel correspondant dans un second canal.

Par conséquent, une position de pixel présentant une forte fluorescence GFP présentera également une forte fluorescence de la cendre en cas de liaison élevée. Pour analyser la corrélation des pixels, assurez-vous que les images REA et GFP en huit bits sont ouvertes dans ImageJ. Ensuite, ouvrez le module complémentaire Image Correlator en choisissant Plugins > Image Correlator. Attribuez les fichiers d'image à l'image un et à l'image deux.

Ensuite, cliquez sur OK. La pile résultante peut ne pas afficher d'informations détaillées. Ceci est normal.

Enregistrez la pile dans un nouveau dossier appelé scatterplots et attribuez-lui le même nom de fichier que l'échantillon auquel il se réfère. Par exemple, Ash GFP Correlation plot. Pour visualiser les données, choisissez l'une des deux options.

Tout d'abord, transformez les données pour les convertir en format logarithmique en choisissant « process math log auto ». Ensuite, pour recaler visuellement les données, cliquez sur « image adjust brightness/contrast » et sélectionnez « auto ». Deuxièmement, recalez visuellement les données afin de ne montrer que les valeurs faibles, puis affichez les données à l’aide d’une table de correspondance spéciale, ou LUT, pour créer une LUT personnalisée.

Cliquez sur l’image pour modifier la LUT de couleur afin d’obtenir une LUT très simple. Cliquez sur le pixel en haut à gauche et choisissez la couleur noire. Ensuite, sélectionnez le pixel suivant à droite et choisissez la couleur rouge.

Ensuite, cliquez sur le troisième pixel, puis, tout en maintenant le bouton de la souris enfoncé, faites glisser la sélection jusqu'au pixel en bas à droite. Sélectionnez la couleur rouge, cliquez sur OK, puis sélectionnez la couleur blanche et cliquez sur OK. Choisissez la plage de luminosité ou de contraste comprise entre 0 et 255, comme décrit précédemment, afin de figer l'image telle qu'elle apparaît à l'écran.

Convertissez-le en format RVB afin de copier et coller les images dans d'autres programmes. Ouvrez d'abord les images en huit bits ou 16 bits comme décrit précédemment. Attribuez un schéma de couleurs LUT aux images pour la GFP.

Attribuez la LUT verte en cliquant sur l'image. Tables de consultation vertes. Enfin, sélectionnez l'image à copier et copiez-la dans le presse-papiers en choisissant Édition → Copier vers le système. Cette figure montre un résultat typique pour la kinase Sock fusionnée, la GFP et une étiquette TC qui a été colorée pendant 30 minutes.

Avec l'ASH dans les cellules HEC 2 9 3, il semble que l'ASH se lie efficacement à la protéine cible portant une étiquette TC avec une forte affinité. En revanche, cette figure montre l'échantillon contrôle correspondant de SARK fusionné à GFP, mais dépourvu de l'étiquette TC, ce qui est essentiel pour vérifier à la fois la spécificité de l'étiquette TC et le niveau de coloration de fond. Ce résultat montre que RH n'a aucune réactivité avec la protéine cible dépourvue de l'étiquette TC, ce qui indique la spécificité de l'étiquette TC pour la liaison à SSH.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas laisser les cellules devenir confluentes et calmes, car cela affecterait la liaison V dans les cellules. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser simplement vos données de façon quantitative, et vous pourrez affiner ces méthodes pour développer votre propre IUTS unique pour la visualisation des données.