Immobilisation bactérienne pour l'imagerie par microscopie à force atomique

La microscopie à force atomique ou une MFA utilise un balayage mécanique d'une surface pour produire des images haute résolution sans nécessiter de traitement chimique de l'échantillon. Dans cette vidéo, des bactéries sont immobilisées sur du mica recouvert de gélatine et observées dans un environnement liquide par MFA. Des carrés de MICA sont d'abord découpés afin de s'adapter à la plateforme du microscope MFA. La couche supérieure du MICA est retirée, puis les carrés de mica sont recouverts de gélatine.

Ensuite, une goutte de suspension bactérienne est déposée sur la mica recouverte de gélatine et étalée. À l'aide d'une pointe de pipette, les échantillons sont incubés pendant 10 minutes. Puis, les bactéries non liées sont éliminées par lavage de la surface.

L'échantillon est placé dans la cellule humide de microscopie à force atomique (AFM) et observé afin d'obtenir des images de haute résolution de bactéries vivantes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la mobilisation sur filtre poreux ISO est qu'elle permet d'immobiliser de manière fiable aussi bien les bactéries en forme de bâtonnet que les bactéries sphériques. De plus, un pourcentage plus élevé de la surface cellulaire est accessible à la sonde AFM.

Un avantage clé de la microscopie à force atomique par rapport à d'autres microscopies est qu'elle permet d'effectuer des études sur des cellules individuelles, permettant d'explorer la morphologie cellulaire, la formation du septum et la cytokinèse. Les personnes novices dans cette méthode éprouvent généralement des difficultés car elles ont tendance à utiliser de la gélatine non validée pour immobiliser les bactéries ou des bactéries cultivées dans un milieu complexe dont les composants peuvent entrer en compétition avec l'adhésion des bactéries à la surface de la gélatine. Nous avons eu l'idée de cette méthode à partir d'expériences remontant aux années 1970, au cours desquelles des bactéries étaient immobilisées.

Des lames en verre recouvertes de gélatine pour des expériences utilisant la microscopie optique et l'autoradiographie. Dans cette démonstration, des bactéries vivantes à Gram négatif sont immobilisées pour une imagerie en MF, mais la méthode s'applique également aux bactéries à Gram positif. Pour préparer le MICA, commencez par le découper avec des ciseaux afin qu'il s'adapte à la platine du microscope en MF et au dispositif humide en MF.

Ensuite, appliquez du ruban adhésif sur la surface du MICA et retirez-le afin de détacher la couche externe du MICA du morceau découpé. Continuez à enlever la couche externe des deux côtés jusqu'à ce qu'il ne reste que des couches lisses et intactes. Pour préparer la solution de gélatine, ajoutez 100 millilitres d'eau distillée dans un flacon de laboratoire et chauffez-la au micro-ondes.

Lorsque l'eau commence à bouillir, retirez-la du micro-ondes, ajoutez 0,5 gramme de gélatine et agitez doucement le flacon jusqu'à ce que la gélatine se dissolve. Notez que les gélatines bovines ne conviennent pas bien à cette procédure. Les gélatines porcines sont recommandées.

Placez le flacon sur le plan de travail et laissez-le refroidir à une température comprise entre 60 et 70 degrés Celsius. Versez ensuite une quantité suffisante de la solution de gélatine dans un petit bécher afin de garantir que le MICA puisse être complètement immergé à l’aide de pinces. Immergez un carré de MICA dans la solution de gélatine tiède, puis retirez-le rapidement. Immédiatement.

Placer la MICA sur son bord, contre une microcentrifugeuse en appui sur une serviette en papier, pour la faire sécher à l'air ambiant toute la nuit. La MICA revêtue de gélatine peut être utilisée pendant au moins deux semaines. Si la MICA revêtue de gélatine n'est pas utilisée pendant quelques semaines.

Placez-le sur du papier filtre dans une boîte de Pétri couverte et conservez-le à température ambiante. La solution excédentaire de gélatine peut être conservée au réfrigérateur et utilisée pendant environ un mois en réchauffant simplement la solution mère entre 60 et 70 degrés Celsius. Il faut veiller à ne pas faire bouillir la gélatine lors du réchauffage.

Avant de déposer les bactéries sur du MICA recouvert de gélatine, assurez-vous que la concentration bactérienne est adéquate. Utilisez un spectrophotomètre pour obtenir une mesure de densité optique de l'échantillon bactérien à 600 nanomètres. Une DO comprise entre 0,5 et 1 est optimale.

Ensuite, transférez un millilitre de la culture dans un tube de microcentrifugeuse et centrifugez pour former un culot selon les paramètres de centrifugation. Utilisez une pipette pour éliminer le surnageant, puis lavez le culot avec un millilitre d'eau déionisée filtrée ou un tampon. Resuspendez délicatement en pipetant doucement plusieurs fois de haut en bas.

Suspendez le culot centrifugé et redisperser immédiatement le culot dans 500 microlitres d'eau déionisée nano pure. La suspension bactérienne doit être visiblement trouble afin d'avoir une concentration adéquate de cellules. Pour une imagerie en microscopie à fluorescence (FM).

Si un choc osmotique est une préoccupation, du saccharose à 0,25 molaire peut être ajouté à la solution d'imagerie. J'ai mis en suspension cette bactérie dans de l'eau, mais n'ayez pas peur d'essayer d'autres liquides. Par exemple, nous avons réalisé cette manipulation avec du saccharose à 0,25 % ; essayez donc d'autres liquides pour voir si cela fonctionne également.

Préparez deux lames pour chaque échantillon. À l’aide d’une micropipette, ajoutez de 10 à 20 microlitres de suspension cellulaire sur la surface recouverte de gélatine. Ensuite, afin d’obtenir une surface suffisante pour une imagerie en microscopie de fluorescence (FM), utilisez la pointe d’une micropipette pour étaler la goutte dans les directions X et Y.

En prenant soin de ne pas toucher physiquement la surface de gélatine avec la pointe de la pipette, incuber l'échantillon pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, rincer à l'aide d'un filet d'eau et éliminer l'excès de liquide en posant le bord de l'échantillon sur une serviette en papier ou du papier filtre. Sécher rapidement l'une des lames à l'aide d'un jet d'azote gazeux.

Ensuite, inspectez visuellement la lame. Une tache opaque indique que les bactéries n'ont pas été éliminées lors de l'étape de lavage. L'autre lame, qui sera désormais utilisée pour l'imagerie, ne doit pas être laissée sécher.

Placez-le sur la platine humide A FM et fixez-le à l'aide des pinces ; à l'aide d'une micropipette, ajoutez de l'eau sur la platine humide. Il est conseillé de préparer le microscope à force atomique avant l'acquisition d'images dans un liquide. Assurez-vous que le levier destiné à l'imagerie en milieu liquide est inséré dans l'A FM et aligné avec le laser.

Procédez à l’imagerie par microscopie à force atomique à l’aide d’un microscope à force atomique Pico Plus, équipé d’une tête de balayage de 100 micromètres et de sondes en nitrure de silicium Vico dont les constantes de raideur nominales varient de 0,01 à 0,1 nano newton par nanomètre. Une fois le microscope préparé, insérez le scanner FM et la platine dans le microscope. Généralement, nous commençons à une vitesse d’imagerie de 0,5 ligne par seconde, allant jusqu’à une ligne par seconde, et la résolution est réglée de 128 points de données par ligne à 512.

Réglez l'instrument pour acquérir des images avec une résolution de 128 à 512 pixels par ligne. Effectuez la numérisation à une vitesse comprise entre 0,5 et une ligne par seconde. Ensuite, si nécessaire, ajustez le point de consigne ainsi que les gains sur le mode AFM afin d'obtenir des images optimales.

Enfin, récupérez les images. Les bactéries E coli ont été déposées sur du MICA recouvert de gélatine comme décrit dans cette vidéo, puis observées en PVS à 0,005 molaire. En utilisant cette méthode.

Les sceptres sont clairement visibles sur l'image recueillie et les surfaces cellulaires sont lisses, ne présentant aucun signe de déshydratation. En comparaison, les images prises du même E. coli à l'air, comme indiqué ici, montrent souvent des structures invisibles en milieu liquide. Dans ce cas, les cellules présentent un aspect annulaire dû à la déshydratation, et des appendices bactériens tels que les FIA peuvent être observés.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des échantillons bactériens pour une imagerie en microscopie à fluorescence (FM) dans un environnement liquide. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure, à condition que les microsurfaces recouvertes de gélatine aient été préparées au préalable. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de choisir la bonne gélatine et d'utiliser une concentration appropriée de bactéries selon ce protocole.

D'autres mesures, telles que l'utilisation du levier de la sonde FN comme outil de détection de force afin d'effectuer des mesures de force sur les surfaces bactériennes, peuvent être réalisées. De plus, des molécules sondes spécifiques peuvent être fixées sur la pointe de microscopie à force atomique (AFM) pour interagir avec des cibles spécifiques à la surface bactérienne, permettant ainsi d'identifier et de mesurer les forces d'interaction. En général, n'oubliez jamais que si vous travaillez avec des bactéries pathogènes, des précautions doivent toujours être prises lorsque vous utilisez cette méthode.