Visualisation de l'ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

L'objectif général de cette procédure est d'observer en temps réel des biomolécules telles que l'ADN et les protéines dans des tampons aqueux à l'aide de la microscopie à force atomique. Cela est réalisé en préparant tout d'abord les biomolécules à imager. Ensuite, on met en place le microscope à force atomique et on positionne la sonde en porte-à-faux en mode FM.

La surface de l'échantillon et les biomolécules d'intérêt sont ensuite imagées et analysées. En définitive, on peut obtenir des résultats révélant la taille, la quantité et l'organisation générales de l'ADN, des protéines et des complexes biomoléculaires hétérogènes dans des conditions tamponnées, grâce à la microscopie à force atomique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des chaperonnes moléculaires, telles que la géométrie STO du complexe formé par les chaperonnes et les co-chaperonnes avec un client.

La démonstration visuelle de cette méthode est bénéfique, car les étapes de préparation de la sonde à levier AFM et de Kent peuvent être difficiles à apprendre à partir d'instructions imprimées, principalement en raison de la complexité liée à leur manipulation physique. La procédure sera démontrée par Morgan Shannon et John Gertz, deux étudiants de mon laboratoire. Pour commencer, isolez les molécules de protéines ou d'ADN à imager et suspendez-les dans un tampon aqueux. Après avoir confirmé la pureté de l'échantillon, incubez-le dans un tampon d'adsorption AFM sur de la glace afin de favoriser l'adhésion de l'échantillon au mica.

Pour les échantillons protéiques, utilisez un tampon heaps de 10 millimolaire. Pour l'ADN, un tampon contenant du magnésium composé de 10 millimolaire de tris, pH 7,5, 10 millimolaire de chlorure de sodium et 2 millimolaire de chlorure de magnésium convient pour monter la sonde AFM. Placez le porte-sonde de cellule liquide sur la station d'installation correspondante du levier.

Localisez le levier en nitrure long et épais de la sonde pointue destinée à l'imagerie. Transférez-le soigneusement vers le porte-sonde pour cellule liquide, en veillant à ce que la pointe reste orientée vers le haut. Ensuite, examinez le levier au microscope optique afin de vérifier qu'il est intact et correctement fixé dans le porte-sonde pour cellule liquide.

Ensuite, retirez soigneusement la tête AFM de l'assemblage en queue d'aronde de l'instrument en resserrant la vis de fixation de la tête. Retournez la tête AFM et insérez fermement le support de sonde de la cellule liquide sur les quatre broches situées à la base de la tête AFM. Enfin, replacez délicatement la tête AFM dans l'assemblage en queue d'aronde de l'instrument.

Pour préparer davantage un microscope à force atomique (FM) avant l’imagerie des échantillons, déplacer les molettes du microscope optique embarqué afin de localiser l’extrémité de la pointe du levier, puis utiliser les flèches haut et bas du contrôleur optique dans le logiciel pour mettre l’extrémité de la pointe du levier au point. Utiliser les molettes de réglage du laser pour aligner le faisceau laser sur l’extrémité de la pointe du levier. Cette étape constitue l’une des plus difficiles sur le plan technique du protocole. Le positionnement s’effectue manuellement et exige un réglage précis des molettes.

Une surveillance attentive du laser au niveau du spot de réflexion et du spot d'illumination augmente les chances d'un alignement réussi. Ensuite, ajustez les molettes du photodétecteur sur la tête AFM afin de centrer le photodétecteur. Placez une feuille de mica fraîchement clivée, fixée sur un disque métallique de spécimen AFM, sur le porte-échantillon magnétisé situé au-dessus de la plaque du support AFM.

Positionnez la plaque porte-échantillon FM de manière à ce que le disque d'échantillon soit en place pour l'observation initiale. Utilisez la commande de surface de mise au point du logiciel de l'instrument pour abaisser la tête FM vers la surface du disque d'échantillon MICA. Poursuivez jusqu’à ce que des structures distinctes apparaissent nettes sur la surface du MICA ou que le reflet de la pointe soit au point, puis sélectionnez l'icône de réglage dans le logiciel de l'instrument et réglez le levier.

La fréquence de résonance des sondes MSNL ou SNL recommandées est comprise entre 20 et 60 kilohertz. Sélectionnez un décalage de crête de 5 % pour imager l'échantillon MICA. Engagez d'abord la sonde sur la surface MICA, réglez la taille initiale de balayage à 10 micromètres et la vitesse de balayage à un hertz.

Capturez des images complètes de balayage du champ de 10 micromètres. Réduisez ensuite la taille de balayage à cinq, un et 0,5 micromètre, et capturez des images complètes de chaque champ. Désengagez la sonde en cliquant une fois sur l'icône de désengagement dans le logiciel de l'instrument.

Pour imager les biomolécules d'intérêt, mélangez cinq microlitres de l'échantillon préparé avec 45 microlitres de tampon d'absorption frais. Ajoutez soigneusement 50 microlitres de la solution contenant la biomolécule à 0,5 microgramme par millilitre directement sur la surface des MICUs. Attendez cinq minutes afin que les biomolécules présentes dans l'échantillon adhèrent à la surface de Micah.

Ensuite, pipeter un supplément de 50 à 100 microlitres de tampon d'absorption dans le porte-sonde de la cellule liquide. En prenant soin de ne pas toucher la sonde, une tête FM ou du MICA avec l'embout de la pipette, réajuster le détecteur photoélectrique et réaligner le laser sur le levier au besoin. Puis utiliser le logiciel de l'instrument pour réengager la sonde.

Augmentez la taille de balayage afin d'identifier les régions d'intérêt. Une fois l'acquisition d'images terminée, sélectionnez plusieurs fois l'icône de retrait dans le logiciel de l'appareil pour désengager la sonde. Enfin, rincez soigneusement avec de l'eau distillée le porte-sonde de la cellule liquide et le disque d'échantillon.

Ensuite, essayez avec de l'air comprimé. Un exemple d'image A FM est montré ici. Le substrat de mica fournit une surface moléculairement plane sur laquelle l'ADN et les protéines peuvent s'adsorber.

L’imagerie de MICA avant l’analyse d’échantillons de biomolécules fournit un contrôle négatif et une évaluation du bruit d’imagerie. Elle offre également un indicateur de confiance quant au bon réglage du levier et à la réussite ultérieure de l’imagerie de l’échantillon. L’ADN plasmidique double brin, présumé superenroulé, est facilement identifiable par son aspect asymétrique et son dépôt uniforme sur le substrat MICA, auparavant sans particularité notable.

Les complexes protéiques de tailles de particules discrètes sont également clairement distinguables du substrat Micah. Les différences de taille des particules indiquent une hétérogénéité de l'échantillon et peuvent être utiles pour estimer la stœchiométrie, la géométrie ou l'activité biochimique des protéines ou des complexes. La forme diagonale générale et l'orientation constante des particules protéiques observées.

Voici un artefact d'imagerie, les protéines étant prévisiblement orientées sur le substrat Micah de manière aléatoire. Les causes possibles de cet artefact observé incluent une anomalie physique de la pointe ou une imagerie en mode FM effectuée à une vitesse de balayage trop élevée, tandis que la convolution de la pointe empêche les calculs de mesures de longueur absolue selon les axes X et Y, ou de hauteur selon l'axe Z. Toutefois, les mesures relatives selon les axes X et Y peuvent néanmoins être utiles pour estimer les propriétés biophysiques des biomolécules imagées. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien penser à régler précisément le levier et à aligner le détecteur photoélectrique, en suivant cette procédure de base en mode FM.

D'autres étapes, comme l'utilisation d'une cellule à échange tampon, peuvent être ajoutées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la capacité des chaperonnes moléculaires à influencer le relâchement des récepteurs stéroïdiens à partir de leurs éléments de réponse ADN. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez mieux comprendre comment imager des protéines de l'ADN et des complexes biomoléculaires par microscopie à force atomique dans des conditions tamponnées.