Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l'hippocampe de souris à l'aide

L'objectif de cette procédure est d'utiliser l'électroporation in utero afin de visualiser et de manipuler génétiquement les dendrites et les épines dans le cortex cérébral et l'hippocampe de la souris. Cela est réalisé en injectant d'abord la solution d'ADN du plasmide souhaité dans le ventricule latéral d'embryons in utero. Ensuite, en utilisant différentes positions des électrodes Palo.

Conformément à l'injection d'ADN, le cortex cérébral ou l'hippocampe est électroporé, puis aux stades postnataux ou adultes souhaités. Les souris sont perfusées et les cerveaux sont prélevés. Enfin, les cerveaux sont sectionnés à l'aide d'un vibromicrotome.

En fin de compte, les dendrites et les épines peuvent être visualisées à l'aide de la microscopie confocale. La technique de l'électroporation unitaire présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes d'étude des dendrites et des épines. En effet, cette technique permet tout d'abord d'étudier cet aspect directement in vivo.

De plus, par rapport à la génération de souris invalidées, l'électroporation in utero constitue une méthode rapide pour étudier l'effet de la suppression ou de l'expression génique dans le cerveau et la moelle épinière, non seulement dans des structures cellulaires spécifiques, mais également à un stade précis du développement. L'utilisation d'un système inductible en électroporation in utero est également un outil utile pour identifier les interactions fonctionnelles entre gènes impliqués dans le développement du cerveau et de la moelle épinière. En effet, contrairement aux virus, par exemple, il nous est facile de combiner plusieurs ARNdh ou plusieurs gènes cibles dans une même population cellulaire. Commencez par diluer l'ADN aux concentrations souhaitées dans de l'eau et ajoutez du colorant vert rapide jusqu'à une concentration finale de 0,05 %. Utilisez un tireur de microélectrodes pour fabriquer des micropipettes en verre destinées à l'injection.

Placer une souris gravide dans une chambre d'induction anesthésique utilisant de l'isoflurane et ouvrir l'oxygène jusqu'à deux litres par minute. Lorsque l'animal perd son réflexe de redressement, la transférer vers un masque préopératoire. Appliquer une goutte d'IGEL sur chaque œil et utiliser un rasoir électrique pour raser les poils de l'abdomen.

Nettoyez la zone rasée une fois avec de la chlorhexidine afin de recueillir les poils en suspension. Transférez l'animal vers un deuxième masque dans la zone chirurgicale, le dos sur le tapis chauffant. Commencez la chirurgie lorsque le réflexe palpébral a disparu.

Mettez un masque et des gants stériles, puis recouvrez l'animal d'un champ stérile. Nettoyez la zone rasée au moins trois fois avec de la chlorhexidine. Utilisez un scalpel pour pratiquer une incision verticale le long de la ligne médiane à travers la peau.

À l’aide de ciseaux, effectuez une incision similaire sur le muscle de l’abdomen le long de l’articulation du coude. Choisissez les embryons les plus accessibles.

Placer la pince en anneau entre deux embryons et extraire délicatement la chaîne embryonnaire de la cavité abdominale. À partir de ce moment, maintenir les embryons hydratés avec du PBS stérile préchauffé. Utiliser la pince en anneau.

Manipulez délicatement la position de l'embryon à l'intérieur de la poche amniotique et stabilisez la tête entre les anneaux. Appliquez une légère pression pour faire remonter l'embryon plus près de la paroi utérine. De l'autre main, prenez le porte-capillaire et insérez soigneusement l'aiguille au milieu de l'hémisphère afin de cibler le ventricule latéral.

En prenant soin de minimiser les mouvements de l'aiguille à la surface de la paroi utérine et en évitant de percer les vaisseaux sanguins, appuyez sur la pédale pour injecter environ 0,5 microlitre de solution d'ADN vert. Placez les électrodes sur les côtés de la tête de l'embryon, la pédale positive étant du même côté que le ventricule injecté pour une électroporation corticale, ou du côté opposé au ventricule injecté pour une électroporation hippocampique. Appliquez ensuite cinq impulsions électriques de 30 volts d'une durée de 50 millisecondes à des intervalles d'une seconde.

Évitez d'appliquer un courant à travers le placenta, car cela entraînerait la mort de l'embryon. Pour augmenter les chances de survie, injectez et électroporez tous les embryons en moins de 30 minutes. Une fois l'intervention terminée dans le tampon PBS, refermez la cavité abdominale et utilisez une pince en anneau pour replacer la corne utérine à son emplacement d'origine. Utilisez des sutures résorbables en vicryl pour fermer l'abdomen, la paroi et la peau. Placez l'animal dans une chambre de récupération jusqu'à ce qu'il se réveille.

Ensuite, transférez-le dans une cage placée sur un tapis chauffant 24 et 48 heures après la chirurgie. Vérifiez le comportement de la souris afin d’évaluer la douleur, la souffrance ou le stress, et pesez l’animal pour analyser les cerveaux. Aux stades postnataux, utilisez un vibrotome pour sectionner les cerveaux préalablement perfusés et post-fixés, puis montez les sections dans un milieu de montage aqueux (Aqua Poly Mount) afin d’imager les dendrites et les épines.

Cette figure montre des exemples de cellules électroporées dans le cortex cérébral, le CA1 et le gyrus denté de l'hippocampe, chez des souris de type sauvage électroporées à E14,5, où la construction GFP et les cerveaux ont été prélevés au 14e jour postnatale. En injectant un petit volume de solution d'ADN, quelques cellules sont marquées, ce qui permet de visualiser l'arborisation dendritique de cellules isolées positives pour la GFP, ainsi que leurs épines à un grossissement plus élevé. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'injecter un petit volume d'ADN afin de cibler seulement quelques cellules, et de pouvoir visualiser et quantifier les épines des neurones électroporés.