Test de sensibilité aux antimicrobiens du complexe Mycobacterium tuberculosis des drogues de première et deuxième par dilution en bouillon dans un format microplaque

Il existe relativement peu de médicaments disponibles pour traiter le mycobactérium tuberculeux, de sorte que la résistance à un médicament quelconque est une préoccupation. Cet article vidéo décrit une procédure permettant de tester simultanément la résistance aux antibiotiques de M. tuberculosis à 12 médicaments antimicrobiens différents. Ainsi, la capacité de détecter rapidement la résistance antimicrobienne de M. tuberculosis revêt une grande importance dans les efforts visant à contrôler l'augmentation des souches résistantes. Ici, pour tester la sensibilité aux antibiotiques.

M. tuberculosis est d'abord cultivé sur milieu solide ou en milieu liquide, afin d'obtenir une suspension bactérienne. L'inoculum est préparé et ajouté dans une plaque de microdilution contenant différentes concentrations de 12 médicaments, incluant des agents de première et de deuxième ligne. Après incubation, l'importance de la croissance dans chaque puits est déterminée soit manuellement à l'aide d'une boîte-miroir, soit à l'aide d'un lecteur de plaque semi-automatisé.

Les données obtenues indiquent la concentration minimale inhibitrice pour chaque médicament testé et montrent quels antibiotiques la souche de tuberculose testée résiste. Ces résultats aident à choisir le médicament approprié pour le traitement de la tuberculose. Bonjour, je m'appelle Nancy Ek et je suis directrice du laboratoire de bactériologie mycobactérienne à la clinique Mayo à Rochester, Minnesota.

Aujourd'hui, nous allons décrire une méthode de test de sensibilité aux antibiotiques pour Mycobacterium tuberculosis. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la dilution en bouillon macroscopique, est qu'une CMI est déterminée pour chaque antibiotique, et que 12 antibiotiques sont testés simultanément. La procédure sera démontrée par Kurt Jude, spécialiste de la qualité dans mon laboratoire, travaillant sur un plan de travail de laboratoire.

Préparez cette procédure en étiquetant une boîte de gélose au sang, trois boîtes de gélose Middlebrooks sept H 10, un tube en verre contenant des billes de verre dans une solution saline Tween, et une plaque de microtitration avec le nom du patient et le numéro d'identification de l'échantillon. En outre, étiquetez la gélose au sang et les géloses sept H 10 comme étant destinées au contrôle de pureté. Indiquez sur l'une de ces géloses sept H 10 « dénombrement de colonies 1:1 » et sur l'autre « dénombrement de colonies 1:50 ».

Ensuite, placez le plateau dans le sas de passage. Préparez-vous ensuite à travailler dans l'installation de biosécurité de niveau trois (BSL-3) en portant une blouse à fermeture frontale, une coiffe, des gants, des surchaussures et un respirateur. Ici, un respirateur PAPR est utilisé.

Ensuite, retirez le plateau du sas de passage. Puis, dans l'installation de niveau de sécurité biologique 3, désinfectez la surface de la hotte de sécurité biologique. Placez ensuite une serviette en papier imbibée de désinfectant à l'intérieur de la hotte, à environ quinze centimètres du panneau de ventilation d'air, à côté de la serviette en papier.

Placer des boucles de prélèvement, des pipettes et des embouts, un contenant approprié pour l'élimination des déchets, un néphi, un TER et un vortex. Une fois la hotte préparée, placer l'organisme sur la serviette en papier, ainsi qu'un porte-tubes contenant un étalon McFarland 0,5, un bouillon sept H neuf avec OADC et un tube de billes salines. Ce montage est réalisé à partir d'un milieu solide.

Préparer l'inoculum à partir d'une culture sur milieu solide provenant d'un prélèvement du patient. Utiliser une anse stérile pour prélever les colonies et les transférer dans le tube en verre contenant du sérum physiologique avec des billes de verre et du Tween. Vortexer la suspension pendant 30 à 60 secondes.

Inspectez visuellement l'échantillon en le comparant à l'étalon de McFarland. La quantité transférée doit être égale ou supérieure à celle de l'étalon. Sinon, ajoutez davantage d'échantillon bactérien et vortexez à nouveau.

Une fois l'étalon de McFarland ajusté, laisser l'inoculum se décanter pendant 15 minutes afin de permettre aux plus gros agrégats de bactéries de se déposer. Ensuite, utiliser un nefi TER pour mesurer la densité des bactéries en suspension et la régler à zéro. Le nephi ter.

Placez d'abord un tube témoin contenant des billes salines Tween dans le Nephi ter. Appuyez sur le bouton d'étalonnage pour mettre l'appareil à zéro, puis insérez l'étalon McFarland 0,5 dans le Nephi ter et appuyez à nouveau sur le bouton d'étalonnage. Une fois l'appareil étalonné, retirez l'étalon McFarland et insérez l'inoculum.

La lecture de l'inoculum doit être égale à celle de l'étalon de McFarland. Si la lecture est trop faible, retirez le tube et transférez davantage de bactéries depuis la boîte. Ensuite, vortexez et relisez l'échantillon.

Si la lecture est trop élevée, ajoutez du Tween salin au tube et vortexez. Ensuite, relisez l'échantillon. Continuez à ajuster l'inoculum selon les besoins jusqu'à ce que la concentration des bactéries corresponde à l'étalon de McFarland.

Ensuite, utilisez une pipette de 200 microlitres et une longue pointe de pipette résistante aux aérosols pour prélever 100 microlitres d'inoculum dans le tiers supérieur du tube. Pour éviter tout agrégat en cours de décantation vers le fond, inoculez lentement le bouillon Middlebrook 7H9, puis vortexez délicatement le bouillon inoculé pendant 20 secondes afin de préparer l'inoculation. Commencez par retirer la plaque microtitration de son emballage d'origine. Si l'agent desséchant est bleu ou si l'emballage en aluminium est endommagé, ne l'utilisez pas.

La plaque contient déjà les 12 antimicrobiens à tester dans chaque puits, y compris les médicaments les plus efficaces ou de première intention ainsi que les médicaments de deuxième intention. Versez soigneusement l'inoculum de bouillon H neuf dans un tube en prenant soin de ne pas générer d'aérosols. Ensuite, placez la plaque de microtitration avec l'étiquette tournée vers l'extérieur comme indiqué ici, et utilisez une pipette à 12 canaux pour ajouter 100 microlitres d'inoculum dans chaque puits.

Ensuite, préparez les boîtes pour effectuer le dénombrement des colonies. Commencez par préparer une boîte non diluée en transférant un inoculum d'un microlitre d'échantillon depuis le puits témoin positif vers la boîte H 10 étiquetée 1 à 1. Utilisez ensuite l'inoculateur pour tracer la stries sur la boîte comme indiqué ici.

Ensuite, pour préparer une dilution au 1/50, transférez un bouillon de un microlitre depuis le puits témoin positif et mélangez-le dans le tube contenant 50 microlitres d'eau de rinçage. Déposez un microlitre de cette dilution sur la boîte marquée 1/50. Ensemencez les boîtes de contrôle de pureté en pipetant 50 microlitres de l'inoculum provenant du trth sur des boîtes d'agar sang et des boîtes 7H10 correctement étiquetées, puis réalisez un ensemencement en rayures pour isolation.

Ensuite, superpose un autre trth sur le trth inoculé et les placer délicatement dans le récipient de rebut. Appliquer un scellé adhésif sur la plaque de microtitration. Puis, à l’aide du support blanc, appuyer fermement sur chaque puits pour assurer un scellement adéquat, en veillant à ce qu’il n’y ait aucune ride.

Désinfectez la plaque de microtitration en l'essuyant avec une serviette en papier imbibée d'un désinfectant tuberculocide. Ensuite, placez la plaque de microtitration dans un sac en plastique et fermez-le à l'aide d'une soudure thermique. Enfin, désinfectez tous les matériaux, y compris le néphi, le vortex filtre, les plaques et les tubes, en les essuyant avec un désinfectant tuberculocide.

Ici, le Pro Spray est utilisé après un temps suffisant écoulé pour assurer la désinfection. 15 minutes pour le Pro Spray. Les boîtes sont fermées avec du ruban adhésif transparent, placées dans des sacs en plastique, puis les fournitures scellées sont retirées de la cabine de sécurité biologique et placées dans le sas de passage.

Le sac rouge de déchets est fermé et scellé avec une pince en ce moment, retirez la blouse, les surchaussures et les gants. Après être passé dans la salle d'antichambre et vous être lavé les mains, retirez le respirateur, désinfectez-le et rangez-le après vous être de nouveau lavé les mains, mettez une blouse propre et quittez la salle BSL-3. Ensuite, le contenant de déchets est stérilisé en autoclave.

Incuber ensuite la plaque microtitration et les sept plaques H 10 et de prélèvement sanguin à l'endroit, dans une étuve à 35 à 37 degrés Celsius avec 5 à 10 % de CO2, en laboratoire de niveau de sécurité biologique 2. Cette procédure est acceptable car la plaque est bien scellée et placée dans un sac en plastique. Le temps de génération de Mycobacterium tuberculosis est d’environ 12 à 24 heures ; ainsi, il faudra au moins une semaine avant qu’une croissance soit visible sous forme de culot cellulaire au fond du puits témoin. Au jour 10, effectuer une lecture manuelle au miroir en plaçant la plaque scellée de microtitration AST sur la plateforme de la boîte à miroir.

Utilisez une lampe de bureau pour faciliter la visualisation de la croissance et ajustez si nécessaire afin d'obtenir le meilleur contraste. Vérifiez les puits de contrôle de croissance dans ce cas, H 11 et H 12, en regardant dans le miroir. S'il y a croissance, le puits apparaîtra trouble ou semblera présenter un sédiment comme illustré ici.

S'il n'y a aucune croissance, comme illustré dans cet exemple, le puits apparaîtra clair. Dans ce cas, remettez la plaque dans l'incubateur et poursuivez l'incubation jusqu'à 21 jours. Pour chaque condition, comparez la croissance au témoin.

Alors, pour chaque médicament, la première dilution n'ayant aucune croissance correspond à la concentration minimale inhibitrice, ou CMI, du médicament. Pour analyser les résultats à l'aide d'un lecteur de plaques automatisé tel que le Vision, commencez par ouvrir le logiciel Myco TB a ST Plate et connectez-vous. Placez la plaque scellée avec le code-barres tourné vers l'extérieur. Comme indiqué ici, la croissance apparaît sous forme de turbidité ou de dépôt de cellules au fond d'un puits à l'écran de l'ordinateur.

Tout d'abord, examiner les témoins de croissance. Comme précédemment. Si la croissance est négative, remettre la boîte de Pétri dans l'incubateur pendant un maximum de 21 jours.

Si ce résultat est positif, enregistrez les résultats en touchant le premier puits qui ne présente pas de croissance à l'écran, pour chaque médicament. Dans certains cas, les bactéries, les sédiments ou les médicaments précipitent au fond du puits. Ce phénomène, appelé traînage, est indiqué par plusieurs puits présentant un culot de même taille et n'est pas considéré comme une croissance réellement positive.

Ensuite, les sept boîtes de gélose H 10 et de gélose au sang sont examinées pour déterminer les concentrations bactériennes et évaluer la pureté. La boîte de gélose au sang ne doit montrer aucune croissance après 48 heures. Une croissance sur la gélose au sang indique une contamination par des bactéries à croissance rapide.

S'il y a une croissance, le test en microplaque doit être répété. La plaque de pureté H 10 sept doit présenter la croissance d'un seul organisme. La souche EM de tuberculose doit apparaître de couleur beige, ridée, et rugueuse. En cas de contamination, le test en microplaque doit être répété à partir d'une culture pure.

Pour évaluer la concentration bactérienne, comptez les colonies sur la plaque H 10 sept. Ensuite, à l'aide du tableau figurant dans le document écrit joint, calculez les nombres de colonies. Mycobacterium tuberculosis a été cultivé à partir d'un prélèvement de patient et la résistance aux antibiotiques a été évaluée comme décrit dans cette vidéo ; sur la plaque présentée ici, 12 antibiotiques différents sont présents à des concentrations croissantes, les concentrations les plus élevées se trouvant en haut et les plus faibles en bas.

La concentration minimale inhibitrice, ou CMI du médicament, était indiquée par la plus faible concentration du médicament n'ayant montré aucune croissance et est entourée sur l'image présentée ici, en utilisant des seuils normalisés établis par l'Institut des normes cliniques et de laboratoire. Les données présentées ici suggèrent que cette souche de tuberculose sera résistante à l'Isid et à la rifampicine. In vitro, les hautes CMI observées pour plusieurs autres médicaments, notamment l'oin, la moxifloxacine, la streptomycine et la rifabutine, suggèrent la résistance de la souche de tuberculose multirésistante à ces agents.

Les résultats de la CMI doivent être utilisés par un spécialiste des maladies infectieuses expérimenté dans le traitement de la tuberculose afin d'élaborer un plan de traitement individualisé. Une fois maîtrisée, cette technique prend environ 40 minutes pour mettre en place un isolat. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler qu'il s'agit d'un agent pathogène respiratoire et que la génération d'aérosols est possible. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mise en œuvre du test de sensibilité aux antimicrobiens de Mycobacterium tuberculosis par la méthode de microdilution en bouillon. N'oubliez pas que le travail avec Mycobacterium tuberculosis peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que la protection respiratoire doivent toujours être prises là où elles sont requises.