Microfabriqués post-Array-détecteurs (mPADs): une approche pour isoler les forces mécaniques

Bonjour, je suis Nathan Snia Decky, et avec moi aujourd'hui se trouvent Wes Ligan, Robbie Desai et Mike Yang. Nous venons tous du laboratoire de Chris Chen à l'Université de Pennsylvanie. Dans cette vidéo, nous présenterons notre méthode de mesure des forces d'attraction cellulaire à l'aide d'un réseau microfabriqué de piliers.

Les forces de traction sont générées par les interactions entre la myosine et l'actine et jouent un rôle important dans notre physiologie. Pendant le développement, elles permettent aux cellules de se déplacer d'un endroit à un autre afin de former les structures précoces de nos tissus. Elles contribuent également au processus de cicatrisation, car elles sont nécessaires à la fermeture des plaies ou à la migration et à la migration des leucocytes à travers notre organisme.

Mais malheureusement, ces mêmes forces peuvent nuire à notre santé dans le cas de la métastase cancéreuse ou de la croissance vasculaire vers une tumeur. Il existe donc très peu de méthodes permettant de mesurer quantitativement ces forces de traction, notamment à l’échelle microscopique et nanométrique des cellules individuelles. La plupart des méthodes courantes pour étudier les cellules in vitro utilisent des boîtes de culture à fond en verre ou en polystyrène, mais ce sont des substrats très rigides qui ne nous permettent pas de mesurer physiquement les forces de traction ni les déformations provoquées par une cellule.

Il a donc été très difficile de comprendre les mécanismes sous-jacents des forces de traction en l'absence de mesures physiques directes. C'est pourquoi, dans le laboratoire de Chris Chen, nous disposons d'une technique qui nous permet de surmonter ces limitations. Notre méthode repose sur un réseau vertical de micro-cantilevers flexibles, dont la rigidité et l'échelle de taille sont telles qu'une cellule individuelle s'étend sur plusieurs cantilevers et les déforme au cours du processus.

Les dimensions que nous utilisons le plus fréquemment sont des cylindres de trois micromètres de diamètre, de dix micromètres de hauteur, espacés de neuf micromètres entre leurs centres, disposés selon un réseau rectangulaire. Toutefois, ces dimensions peuvent être modifiées afin de s'adapter à divers types d'études cellulaires. Nous partons d'un moule rigide en silicium, que vous pouvez voir ici, puis nous les transposons en leviers flexibles en PDMS, que nous observons ici.

Grâce à cette technique, nous pouvons mesurer les déflexions de leviers individuels au microscope et en déduire les forces de traction cellulaire, en intensité et en direction, nécessaires pour produire de telles déflexions. Nous avons transformé ces substrats en plateformes M pour détecteurs à réseau de micro-piliers, et dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment fabriquer les plateformes M, depuis le moule en silicone jusqu'à la réplication en PDMS, et enfin jusqu'au calcul de la modulation et de la contractilité cellulaire. Bonjour, nous sommes ici dans la salle propre de notre laboratoire.

Il s'agit d'une salle exempte de poussière et sensible à la lumière, qui nous permet de fabriquer les plots en SU-8 qui serviront de moule en silicium. Nous partons d'une tranche de silicium que nous recouvrons d'un résine photosensible SU-8, une résine négative sensible à la lumière. Ainsi, lorsque nous exposons cette résine à travers un masque photolithographique, la lumière dessine le motif des microplots, formant une structure tridimensionnelle qui donnera les plots en SU-8, puis reproduite dans du PDMS.

Après avoir effectué tous nos traitements, la plaquette aura cet aspect, avec les micro-piliers et les structures de micro-piliers déjà fabriqués dans la plaquette. Pour fabriquer les matrices, nous commençons par une plaquette de silicium vierge, que nous avons nettoyée par un traitement à l’ozone pendant sept minutes, puis déshydratée pendant 30 minutes à 120 degrés Celsius. Nous allons déposer par centrifugation du SU-8 2002 sur celle-ci afin de former une couche de base très fine pour les piliers.

Étant donné que nous allons centrifuger du SU-8, je vais porter un masque à gaz, recharger la plaquette dans ce porte-échantillon ici, enlever toute poussière éventuelle, la placer sur le centrifugeur, puis nous vérifierons qu'elle est bien centrée. Ensuite, nous procéderons au versement du SU-8 2002 sur celle-ci. Puis nous lancerons la centrifugation de la plaquette. Nous placerons ensuite celles-ci sur la plaque chauffante, pour la cuisson douce.

Nous faisons cela pendant une minute ensuite. Puis, nous le prélevons et le transférons sur la plaque chauffante à 95 degrés. Et nous faisons cela pendant deux minutes.

Et lorsque cela est terminé, nous prendrons cet échantillon pour effectuer l'exposition par flood dans l'aligneur de masque. Bon, nous venons de centrifuger le SU-8, la première couche de SU-8 sur cette plaquette, et maintenant nous devons exposer uniformément l'ensemble de la plaquette afin de créer cette première couche de base pour les micro-piliers. Nous devons donc lui fournir une exposition de 70 millijoules.

Nous devons donc mesurer l'intensité réelle de la lumière dans notre aligneur de masque ici. Nous insérons le détecteur dans l'appareil. Ensuite, nous l'exposons à la lumière.

Il s'agit de lumière UV ici. Nous chargeons la plaquette de silicium sur l'aligneur de masque et la plaçons dans l'aligneur de masque. Cette fois, nous n'avons pas de masque, ce qui nous permet d'exposer l'ensemble du film.

Mettons l'obturateur en place et réglons une exposition d'une minute, puis procédons à l'exposition. Après une minute, le système a terminé ; nous pouvons alors retirer la plaquette. Nous devons maintenant effectuer la cuisson post-exposition.

Nous venons donc d'exposer cette plaquette et nous allons maintenant appliquer de la chaleur pour provoquer la réaction de réticulation de cette première couche de SU-8. Nous la plaçons donc sur une plaque chauffante à 65 °C pendant une minute, puis nous la transférons sur une plaque chauffante à 95 °C pendant deux minutes. À l'issue de ces deux minutes, nous éteignons la plaque chauffante et laissons la plaquette refroidir jusqu'à la température ambiante, ce qui prend environ 30 minutes.

Nous avons donc déposé une deuxième couche de SU-8 sur cette plaquette. Et maintenant, nous devons réellement l'exposer à travers le masque photolithographique. Cette fois, nous allons utiliser un filtre UV pour bloquer la lumière UV profonde.

Il s'agit d'un verre optique Hoya que vous pouvez obtenir, mais cette fois, nous devons de nouveau mesurer l'intensité. Nous allons donc utiliser notre luxmètre ou bien le filtre placé au-dessus pour mesurer l'intensité qui a été filtrée. Ensuite, nous allons charger le masque dans l'aligneur de masque.

Cet interrupteur crée un vide qui maintient le masque en place. Nous le placerons ensuite dans l'aligneur de masque. Nous poserons ensuite le filtre par-dessus, puis chargerons notre plaquette.

Nous voulons nous assurer qu'il y a un bon contact, nous le soulevons donc pour établir le contact, puis nous commencerons l'exposition. Après l'exposition, nous sortirons notre plaquette de l'aligneur de masque. Nous avons maintenant des zones qui ont été exposées sélectivement. Nous emmenons ceci au four, sur les plaques chauffantes, pour effectuer la cuisson post-exposition.

Nous venons d'effectuer le PO, la cuisson finale après exposition, et nous allons maintenant développer cette plaquette afin d'obtenir les structures tridimensionnelles. Nous allons rincer celle-ci et la développer dans du P-G-M-E-A, ce qui permettra d'éliminer le SU-8 non exposé. Nous commençons donc par placer la plaquette dans un premier bain de P-G-M-E-A, où elle reste pendant deux minutes avec une agitation douce.

Je vais donc laisser agir pendant deux minutes. Ensuite, nous allons transférer dans un deuxième plat contenant du P-G-M-E-A. Cela permettra d'éliminer le P-G-M-E-A saturé avec le SU huit.

Après 10 secondes, nous l'immergeons dans du IPA. Cela élimine le P-G-M-E-A. Nous le laissons ici pendant 20 secondes, à nouveau avec une agitation douce.

Ensuite, nous avons actuellement les structures de poteaux libres. Nous allons donc les plonger dans de l'hexane, qui possède une faible tension superficielle. Nous allons rincer pendant cinq secondes dans un premier puis un deuxième bain d'hexane, puis nous serons prêts à les sécher à l'air comprimé.

Nous venons donc de développer la plaquette et nous allons maintenant la placer sur un bloc chauffant, puis augmenter lentement la température jusqu'à 150 °C. Cette température plus élevée provoque une réticulation supplémentaire du SU-8, rendant ainsi le matériau plus rigide sur le plan structural. Nous laissons la plaquette sur le bloc chauffant toute la nuit, soit entre 14 et 20 heures. Ensuite, nous éteindrons le bloc chauffant et laisserons celui-ci refroidir jusqu'à la température ambiante.

Ce que nous devons faire, c'est découper cette plaquette en un format plus petit. Nous voulons essentiellement couper cette plaquette de silicium afin de créer une petite puce ne comprenant que ce motif interne ici. Et cela aura une allure similaire à cette structure, où ils utiliseront de l'époxy.

Et nous allons coller cette puce sur une lame en verre comme ceci. Cela fournit un support structurel. Pour découper une plaquette, c'est un peu un art, mais ce que vous pouvez faire, c'est utiliser essentiellement un stylet en diamant et commencer à partir d'un seul bord.

Et en raison des plans cristallins, vous faites simplement une petite entaille. Cela crée une fracture que je peux ensuite frapper avec cet outil. Nous pouvons détacher cette partie et effectuer d'autres coupes ici jusqu'à obtenir une petite structure comme celle-ci. Ensuite, vous placez rapidement la puce de silicium sur le verre et vous la fixez en place. Puis vous laissez durcir.

Et donc, une fois que vous avez terminé, vous aurez un dispositif similaire à celui-ci. Nous avons monté le moule en silicium sur cette lame de verre et nous allons maintenant l’enduire de floy, ce qui facilitera le détachement de cette structure du PDMS par la suite. Nous allons donc placer la puce dans ce dessiccateur, puis prélever quelques gouttes de trichlorosilane et en déposer quelques-unes dans le dessiccateur.

Nous effectuons cette opération sous la hotte car cela produit un sous-produit de gaz chlorhydrique, qui est assez agressif. Fermez le couvercle, reliez-le au vide, puis laissez reposer sous aspiration. Nous laissons ensuite ce dépôt se former toute la nuit afin d'obtenir un revêtement uniforme sur toute la surface de la plaquette de silicium. Bonjour, je suis Wesley Ligan.

Je suis étudiant diplômé dans le laboratoire de Christopher Chen. À ce stade, Nate vous a montré comment créer un moule en silicone pour nos substrats ED. Cependant, avant de pouvoir utiliser cet outil pour mesurer la contractilité cellulaire, il est nécessaire de reproduire d'abord les structures photo rigides à l'aide d'un polymère de silicone élastomère.

Notre première tâche consiste à générer un moule négatif du modèle en silicone que nous avons fabriqué précédemment. Nous utilisons pour cela un élastomère de silicone appelé PDMS ou polyméthylsiloxane, auquel nous ajoutons notre polymère PDMS. Nous ajoutons maintenant un agent de réticulation dans un rapport de un à dix.

Une fois la solution pesée, il est nécessaire de mélanger soigneusement le polymère PDMS et l'agent de réticulation. Ce mélange introduit évidemment beaucoup de bulles d'air dans notre solution. À ce stade, il est donc nécessaire de la déboucher et de la dégazer dans un dessiccateur sous vide.

Une fois que le PDMS est complètement dégazé et que toutes les bulles sont remontées à la surface et ont éclaté, nous pouvons le retirer de l'étuve à vide. Nous pouvons désormais utiliser ce mélange de PDMS et d'agent de réticulation pour générer un moule négatif de notre matrice en silicium. Pour ce faire, nous utilisons un plat en métal et y plaçons notre matrice en silicium montée au centre.

Nous versons ensuite soigneusement la solution polymère de DGAs dans la boîte par-dessus le tranchant de la plaquette de silicium, en essayant d'éviter la formation de bulles supplémentaires. Généralement, nous essayons de verser le polymère sur une épaisseur d'environ un quart de pouce. Vous pouvez constater que ce processus introduit inévitablement quelques bulles d'air dans le mélange.

On met donc ce plat de côté pendant environ 30 minutes afin de permettre aux bulles de remonter à la surface et d'éclater. On constate qu'après ce repos, quelques bulles d'air subsistent encore à la surface du PDMS. Toutefois, comme elles se trouvent à la surface supérieure, on peut désormais utiliser un bref jet d'azote pour faire éclater les bulles restantes.

Afin de réticuler complètement le PDMS et la solution de CROSSLINKER et générer un moule négatif rigide de notre matrice en silicium, nous le faisons cuire à 110 degrés Celsius pendant 20 minutes. On peut observer une fine couche de PDMS à la surface du substrat en silicone. Et avant de pouvoir séparer les deux éléments, il est nécessaire de découper préalablement cette couche.

Ensuite, nous pouvons greffer cette couche supérieure et la détacher délicatement du substrat en silicium. À ce stade, nous pouvons retourner et détacher très lentement le substrat négatif en silicium, ainsi que le substrat négatif en PDMS, du moule maître en silicone. Bien, nous procédons en maintenant une extrémité fixe et en détachant doucement le substrat en PDMS.

Vous pouvez observer l'avancée frontale lorsque le substrat se détache du moule maître en silicone. Maintenant que nous avons créé un moule négatif A-P-D-M-S de notre moule maître en silicone, nous pouvons découper celui-ci en quatre moules négatifs individuels afin de fabriquer les substrats définitifs pour les pastilles. À ce stade, il est important de ne pas toucher la surface supérieure du substrat négatif avec des pinces ou vos gants afin d'éviter d'endommager la surface.

À ce stade, nous avons généré quatre gabarits négatifs individuels à partir du moule maître en silicone, composés de puits d'un diamètre de trois microns et d'une profondeur de neuf microns. Afin de régénérer les surfaces en saillie des leviers, nous pouvons procéder à un nouveau moulage sur ces moules négatifs en utilisant du PDMS à base de PDI. Toutefois, avant cela, il est nécessaire de rendre d'abord ces moules négatifs non adhésifs en les recouvrant d'un fluorosilane.

Nous effectuons cette opération dans une chambre à plasma de cent watts, à pleine puissance, pendant une minute. Après avoir laissé la chambre atteindre la pression requise avant de réactiver le plasma, cela génère un champ de gaz ionisé qui grave la surface supérieure du PDMS et la rend plus adhésive aux molécules fluoro Cy Lane. Après avoir retiré les moules négatifs du dessiccateur sous vide, on peut voir ici que ce qui reste est un réseau de puits de trois microns sur dix microns de profondeur, dans une couche de PDMS non adhésive.

Afin de régénérer les leviers verticaux, que nous utilisons pour les substrats mpad, il est nécessaire de procéder à un nouveau moulage à partir de cette structure en utilisant notre mélange de PDMS identique, ce qui nous donnera un réseau positif autoportant de leviers élastomériques, reproduisant exactement le modèle en silicium que nous avons fabriqué précédemment. La première étape de cette procédure consiste à transférer nos moules négatifs non adhésifs sur un support de montage que nous avons conçu à partir de bandes de PDMS et d'une lame de microscope en verre. L'utilité de ce dispositif deviendra claire à l'étape suivante.

À ce stade, nous pouvons déposer une petite goutte de notre mélange identique de PDMS et d'agent de réticulation, dans un rapport de 10 à 1, déjà dégazé, sur la surface supérieure de chacun de nos moules négatifs. Seule une petite quantité de PDMS est nécessaire afin qu'elle ne coule pas sur les bords des moules négatifs. À ce stade.

Afin d'étaler plus complètement le PDMS sur la surface supérieure des moules, nous pouvons en saisir un à l'aide de pinces, l'inverser, puis le mettre en contact avec le moule adjacent en étalant soigneusement le PDMS afin de recouvrir entièrement tout le substrat. Soyez très prudent à cette étape pour ne pas introduire davantage de bulles dans la solution de PDMS. Répétez ensuite l'opération avec les deux autres puits et les deux autres moules. Maintenant que nous disposons d'un revêtement de PDMS plus uniforme sur la surface supérieure, nous pouvons placer ce dispositif dans un dessiccateur sous vide afin d'éliminer davantage les bulles éventuellement piégées dans le film de PDMS au-dessus de nos moules négatifs.

Ce processus prend généralement environ 30 minutes. Pendant que nos moules négatifs dégazent, nous pouvons nettoyer les substrats en verre de 22 par 22 millimètres, qui serviront d'emplacement final de montage pour les pastilles. La première étape de ce processus consiste à éliminer les particules de poussière à l'aide d'azote comprimé.

Nous allons exposer les lamelles de verre à un plasma gazeux, ce qui nettoiera la surface et la rendra plus adhésive au PMS, que nous y fixerons à l'étape suivante. Après avoir laissé la couche supérieure de PDMS en contact avec les DGAs pendant environ 30 minutes et activé les lamelles de verre au plasma, nous pouvons alors retirer notre gabarit et mettre la surface supérieure des lamelles de verre, qui a été exposée au plasma gazeux, en contact avec la couche de PDMS située au-dessus des moules négatifs. Généralement, il est utile de mettre d'abord un bord de la lamelle de verre en contact avec le PDMS, puis de laisser le reste de la lamelle s'abaisser progressivement selon un mouvement de type SH, de sorte que le PDMS s'étale de manière uniforme en couche continue.

Cela permet de réduire les bulles éventuellement introduites dans le film de PDMS. À ce stade, nous pouvons délicatement appuyer sur la surface supérieure du coverslip en verre avec la pince pour expulser tout excès de PDMS, ainsi que pousser le coverslip contre la croix en PDMS située au centre du gabarit. Cela empêchera le coverslip de bouger pendant la polymérisation du PDMS.

Nous répétons cela pour les autres substrats. À ce stade, nous pouvons transférer l'ensemble du modèle dans l'étuve et cuire à 110 degrés Celsius pendant 22 heures. Après avoir laissé l'ensemble du dispositif refroidir à température ambiante, nous pouvons alors retirer nos substrats, les retourner et décoller soigneusement le moule négatif du glaçon de couverture en verre.

Il est important de procéder lentement et de manière uniforme afin d'éviter d'écraser les piliers ou de les arracher du substrat en verre. On peut constater qu'après avoir retiré le moule négatif, il reste un réseau de leviers en porte-à-faux qui reproduit fidèlement le Maître en Silicium, à la différence près qu'ils sont désormais constitués d'un élastomère PDMS flexible. Bon, à ce stade, nous vous avons expliqué comment nous générons le Maître en Silicium de nos substrats Emad.

Nous avons ensuite utilisé un procédé de moulage par réplication pour générer une réplique exacte à l’aide d’un polymère élastomère A-P-D-M-S, de sorte que les leviers soient désormais flexibles, permettant aux cellules de s’étaler, de se contracter et de défléchir les leviers au cours du processus. À ce stade, nos substrats sont prêts à être utilisés pour la culture cellulaire. Maintenant que nous avons vu comment fabriquer et répliquer des moules afin de produire les EDS, nous allons effectuer quelques étapes supplémentaires afin de rendre les EDS fonctionnels, ce qui nous permettra de réaliser des cultures cellulaires et d’analyser par la suite les forces de traction.

Mais avant cela, nous devons effectuer trois opérations. Nous devons rendre les extrémités des piliers adhésives aux cellules. Deuxièmement, nous devons marquer fluoroscopiquement le PDMS afin de faciliter la visualisation et l'analyse des déflexions des piliers.

Et troisièmement, nous devons rendre les parois latérales des piliers ainsi que leur base non adhésives aux cellules, afin que les forces de traction soient exercées uniquement au niveau des extrémités des piliers. Nous verrons donc comment ces étapes sont réalisées grâce à une stratégie basée sur l'impression par micro-contact au cours des minutes suivantes. Mais tout d'abord, l'étape suivante consiste à éliminer l'excès de P-D-S-P-D-M-S des eds.

Comme je l'ai mentionné, la première étape consiste à prendre le substrat EDS, que West vient de vous montrer comment générer et par lequel on les découpe. L'excès de PDMS résultant du durcissement de la lame de verre contre le moule négatif est retiré à l'aide d'une lame de rasoir bien aiguisée. Pour éliminer l'excès de PDMS, vous placez verticalement la lame de rasoir sur le substrat au niveau du bord des piliers, puis vous grattez pour l'enlever.

Et vous pouvez utiliser un doigt pour maintenir la lamelle en place afin qu'elle ne bouge pas. Ce que nous obtenons est donc un substrat de pastilles M qui a été nettoyé des débris et est ainsi facilement accessible. Pour l'étape suivante, nous devons effectuer une impression par micro-contact des MPA afin de rendre les extrémités des plots adhésives.

Pour ce faire, nous devons d'abord générer des matrices, et ce processus est très simple. Nous mélangeons simplement du PDMS selon un rapport de un à trente, au lieu d'un rapport de dix à un. Nous versons le mélange dans une boîte de Pétri de manière à obtenir une hauteur de PDMS d'environ un centimètre.

Laissez-le dégazer, c'est-à-dire laissez les bulles remonter à la surface du PDMS, puis faites durcir la réaction de réticulation au four à 60 degrés pendant une heure. Après avoir retiré la boîte du four et laissé refroidir, je suis maintenant prêt à découper les tampons. Donc, à nouveau, avec le même type de lame de rasoir, découpez simplement en appuyant verticalement vers le bas dans le PDMS jusqu'à ce que vous touchiez le fond de la boîte de Pétri.

À présent, l'orientation du tampon est un élément auquel nous devons prêter attention. La surface du tampon correspond au côté du PDMS qui a été moulé contre le fond de la boîte de Pétri afin de rester plane. Ainsi, dans ce grand carré de PDMS que j'ai découpé, la surface du tampon est maintenant orientée vers le haut.

Ce tampon est désormais beaucoup plus grand que les pastilles M, je vais donc le découper à la taille d'une seule pastille M à l'aide d'une lame de rasoir. Comme il est très difficile de déterminer l'orientation correcte du tampon à l'œil nu, je vais faire une petite encoche sur ce qui sera la face arrière du tampon, c'est-à-dire le côté opposé à la face, comme ceci. Je peux ensuite détacher le tampon du bloc plus grand. J'obtiens ainsi un tampon A-P-D-M-S prêt pour l'étape suivante.

Nous voulons nettoyer les tampons en PDMS. Étant donné qu'il est très probable que des poussières atmosphériques se soient déposées sur les tampons en PDMS pendant que je les découpais, nous procédons ainsi : nous plaçons le nombre souhaité de tampons en PDMS dans ce cristallisoir et remplissons le cristallisoir avec de l'éthanol à 100 %.

Ajoutez simplement suffisamment d'éthanol pour recouvrir la surface des matrices, mais la quantité exacte d'éthanol ajoutée n'est pas importante. Ensuite, placez le disque de cristallisation dans un agitateur et soniquez les matrices pendant cinq minutes. Une fois les cinq minutes écoulées, nous terminerons la stérilisation des matrices et effectuerons le reste de l'impression par microcontact, à savoir la fonctionnalisation des plots M, dans une hotte de culture tissulaire stérile.

Nous sommes maintenant dans la hotte de culture cellulaire, où nous pouvons terminer la stérilisation des matrices. Pour ce faire, nous prenons les matrices depuis la coupelle de cristallisation, les plongeons dans une coupelle remplie d'éthanol afin de rincer tout débris résiduel, puis finalement les trempons dans une coupelle d'eau pour éliminer l'éthanol. Ensuite, à l'aide d'un flux d'azote, nous séchons les matrices jusqu'à ce qu'aucune goutte visible ne subsiste.

La prochaine étape consiste à encrer les tampons avec une solution protéique. La solution protéique utilisée contient 50 microgrammes par millilitre de fibrine dans de l'eau DEI. Prélevez simplement un peu de la solution protéique à l'aide d'une pipette et déposez des gouttes de cette solution sur la face du tampon.

Vous souhaitez faire cela en déposant de petites gouttelettes sur le bord de la face du tampon. Commencez par répéter cette opération pour tous les tampons que vous allez utiliser, et j'aurais dû le faire à l'avance. L'étape suivante, après avoir placé des points sur les bords de tous les tampons, consiste à relier ces gouttelettes et à remplir la face du tampon avec la solution protéique.

La raison pour laquelle nous avons fait cela est que la solution protéique dans les gouttelettes, ainsi que celle située en dessous des gouttelettes, rend la surface du tampon hydrophile, facilitant ainsi l'application uniforme de la protéine de matrice extracellulaire. Répétez donc cette étape pour tous les tampons que vous utilisez. Maintenant que nous avons appliqué la solution protéique sur la face des tampons, la dernière étape du marquage consiste à s'assurer que les bords sont bien recouverts. Pour ce faire, inclinez simplement une pipette et faites-la glisser le long de la face du tampon de manière à entrer en contact à la fois avec le coin du tampon en PDMS et la solution protéique.

Et à nouveau, répétez cette opération pour tous les bords de tous les tampons que vous encragez. Maintenant que nous avons terminé d’encrer les tampons, nous les mettons de côté et les laissons dans la hotte de culture cellulaire pendant une heure afin de permettre une absorption complète de la protéine sur la surface du tampon. Après avoir attendu une heure pour que les protéines s’adsorbent complètement sur la surface des tampons, il est maintenant temps de les rincer à l’eau et de les sécher à l’azote.

Pour ce faire, nous prenons de l'eau stérile et la versons dans la boîte contenant les matrices. Veillez à ne pas verser l'eau directement sur la face de la matrice ; vous pouvez utiliser une pipette si nécessaire. La quantité exacte d'eau n'est pas importante, du moment que vous faites monter le niveau d'eau au-dessus de la solution protéique.

Après cela, à l’aide de pinces stériles, prenez un cachet, plongez-le dans une nouvelle boîte de Pétri contenant de l’eau et séchez-le délicatement avec de l’azote en soufflant. Vous saurez qu’il est sec lorsque vous ne verrez plus de gouttelettes de solution protéique sur le cachet. Répétez cette procédure pour tous les cachets que vous traitez, un par un.

À présent que nous avons rincé les matrices à sec, il est temps d'activer les substrats mpad en les traitant avec de l'ozone UV. Pendant sept minutes, j'ôte le couvercle de la boîte de Pétri par le haut, depuis le sommet de la boîte. Étant donné que le polystyrène absorbe les UV, je place ensuite la boîte dans le traitement par ozone UV, je ferme le tiroir, je règle le minuteur sur sept minutes et je lance le processus.

Nous voilà de retour sous la hotte de culture cellulaire, et il est temps d’imprimer les substrats mpad, qui viennent d’être traités au moyen d’ozone UV. Pour ce faire, prenez les tampons rincés et séchés à l’aide de pinces. Vous pouvez manipuler les tampons par les côtés, mais ne touchez pas la surface du tampon.

Vous souhaitez ajuster le tampon dans la pince afin que le côté protéique soit accessible. Ensuite, vous retournez la pince en gardant à l'esprit que le côté protéique est orienté vers le bas, puis vous approchez lentement le tampon jusqu'au eds. Les tampons numérotés de un à trente sont assez adhésifs, vous devrez donc peut-être utiliser une deuxième paire de pinces pour détacher le tampon de la première pince.

Vous pouvez laisser tomber le tampon d'une hauteur d'environ deux millimètres à environ huit millimètres sur les emeds. Ensuite, inclinez la boîte contenant les emeds vers le haut et appuyez doucement avec une pince afin d'établir un contact entre le tampon et les eds. Vous saurez que le contact est établi selon l'une ou l'autre de deux façons.

La première méthode consiste à observer la surface de l'ED par le côté du poinçon. Cela peut être difficile à voir à la caméra, mais à l'œil nu, je peux clairement constater que le poinçon entre en contact avec la surface en regardant celle-ci à travers le côté du poinçon. La deuxième façon de s'assurer du contact, avec le p, consiste à sortir la boîte de Pétri du flux laminaire avec son couvercle et à l'examiner au microscope inversé.

En visualisant les motifs d'interférence au microscope, vous devriez être en mesure de déterminer quand, et si, le tampon entre en contact avec les eds. Une fois le contact établi, il suffit que le tampon reste en contact avec celui-ci, sur le substrat ed, pendant quelques secondes. Il est donc maintenant temps de retirer le tampon.

Pour ce faire, repliez les Eds vers le bas à l’aide d’une paire de pinces et, d’un seul mouvement fluide, décollez le tampon. Veillez à bien suivre quels Eds ont été tamponnés et quels tampons vous avez déjà utilisés précédemment. Répétez cette procédure une fois par EMPA pour chaque substrat que vous souhaitez utiliser.

Maintenant que nous avons imprimé les EMPA, l'étape suivante consiste à les stériliser, puis à les incuber dans un colorant lipophile appelé dye eye. Dai est une molécule lipophile marquée de manière fluorescente, qui diffuse donc dans le PDMS pendant une durée déterminée, ce qui nous permet de visualiser les déflexions postérieures au microscope. Ce que je vais faire, c'est prendre chaque substrat d'empa individuellement et l'immerger dans de l'éthanol à 100 %, de l'éthanol à 70 %, de l'eau DI, de l'eau DI, de l'eau DI, de l'eau DI.

Et enfin, une solution de cinq microgrammes par millilitre de DII. La solution de DII est fluorescente ; par conséquent, afin de minimiser son exposition à la lumière ambiante et de réduire le photoblanchiment, nous recouvrons les boîtes avec du papier d’aluminium pendant qu’elles incubent dans la hotte de culture tissulaire pendant une heure. Maintenant que nous avons attendu une heure pour que les tampons EM incubent dans la solution de DAI, nous pouvons retirer le papier d’aluminium et rincer la solution de DAI.

Nous rinçons les dispositifs en effectuant trois immersions successives dans de l'eau stérilisée, puis nous les plongeons finalement dans une solution de F1 27 à 0,2 %, soit 0,2 % poids par volume. Pendant toutes les étapes d'immersion, il est essentiel de minimiser le temps d'exposition des pastilles EM à l'air. Cela permet d'éviter d'endommager les substrats ED et, plus précisément, d'empêcher deux plots de s'effondrer l'un sur l'autre.

Le F1 27 à 0,2 % est un copolymère tri-bloc composé de domaines hydrophiles et hydrophobes. On sait que le domaine hydrophile résiste à l'absorption des protéines et donc à l'adhésion cellulaire, tandis que le domaine hydrophobe se lie au PDMS hydrophobe. Ainsi, lorsque le PDMS est immergé dans le F1 27, le F1 27 s'associe au PDMS et empêche l'adhésion cellulaire.

Après une heure d'incubation dans le F1 27 placé dans une boîte de Pétri recouverte de papier d'aluminium, nous pouvons rincer le F1 27 par des immersions successives dans de l'eau stérile, de l'eau stérile puis dans du PBS. Une fois le produit F1 27 éliminé après l'immersion dans le PBS, nous pouvons alors immerger les substrats eds dans une solution de culture cellulaire choisie. La solution de culture cellulaire dans laquelle j'ai immergé les EMPAs peut contenir du sérum et/ou d'autres facteurs de croissance et/ou des suppléments tels que la pénicilline et la streptomycine.

Tous ces ingrédients sont entièrement compatibles avec les traitements EMPA. La prochaine étape, une fois que les EDS ont été immergés dans la solution de culture cellulaire, consiste à ensemencer les cellules choisies sur les EDS. Pour ce dispositif expérimental particulier, je vais ensemencer des cellules endothéliales aortiques pulmonaires bovines dans trois boîtes différentes.

La raison pour laquelle j'utilise trois boîtes différentes est que je vais traiter deux des boîtes avec des inhibiteurs de tactilité connus afin d'inhiber les déflexions des piliers, comme nous pourrons le mesurer ultérieurement. Pour ensemencer les cellules, je prélève simplement ma suspension cellulaire, j'aspire la quantité appropriée dans la pipette, puis je dépose la suspension goutte à goutte dans chaque boîte. J'ajoute suffisamment de cellules pour qu'au moment de réaliser le dosage des forces de traction, les cellules soient présentes sous forme de cellules isolées sur les piliers.

La quantité à ajouter dépend de la surface de répartition ainsi que du taux de croissance de vos cellules spécifiques. Nous ensemence généralement entre 1 500 et 5 000 cellules par centimètre carré de substrat. Une fois l'ensemencement des cellules terminé ou après avoir modifié la suspension cellulaire, ajoutez goutte à goutte la suspension dans la culture, puis agitez doucement la culture plusieurs fois d'avant en arrière selon des directions orthogonales afin de mélanger la suspension cellulaire dans la boîte de culture.

Répétez ce processus pour tous les substrats que vous utilisez. Immédiatement après avoir semé les cellules, placez-les dans une étuve à 37 degrés avec un niveau approprié de dioxyde de carbone pour tamponner le pH et le milieu de culture cellulaire. Environ deux heures après le semis des cellules, il convient de les rincer en transférant les substrats d'une boîte de milieu vers une boîte neuve contenant le même milieu de culture cellulaire.

La raison de ce lavage est que la plupart des cellules auront commencé à s'étaler et auront atteint presque leur surface finale d'étalement au bout de deux heures. En rinçant les cellules, c'est-à-dire les substrats, vous éliminez toutes les cellules en suspension provenant du milieu de culture cellulaire. Ainsi, seules les cellules qui se sont fixées sur l'EDS et qui ont commencé le processus d'étalement seront visibles lors du dosage final des forces de traction.

Un test que nous pouvons réaliser avec des cellules cultivées sur des MPAs consiste en une imagerie en temps réel afin d'examiner quantitativement la dynamique de la contractilité cellulaire. En particulier, la dynamique de la contractilité cellulaire en réponse à des facteurs solubles est intéressante. On sait que des facteurs solubles tels que des composés biologiques et des composés synthétiques peuvent augmenter, réduire ou avoir des effets inconnus sur la contractilité cellulaire.

Pour cette expérience sur cellules vivantes, nous utiliserons ce microscope à fluorescence épi inversé. Sur la platine du microscope, une petite boîte d'incubation est reliée à un régulateur thermique afin de maintenir la température à 37 degrés Celsius avec 5 %CO2. Nous effectuerons l'observation en fort grossissement à l'aide d'un objectif plan APO 60 x.

Nous allons maintenant préparer le substrat d'impact pour l'imagerie. L'objectif de 60 x que nous utilisons pour l'imagerie possède une distance de travail de 200 microns, ce qui est nettement inférieur à l'épaisseur de la boîte de culture tissulaire dans laquelle nous avons semé les cellules précédemment. Par conséquent, nous ne pouvons pas imager les cellules sur les implants dans la boîte de culture tissulaire.

Pour contourner ce problème, nous utilisons ces boîtes à fond en verre. Je vais maintenant transférer le substrat dans la boîte à fond en verre à l’envers, de sorte que les cellules et les extrémités des piliers se trouvent à l’interface du fond en verre. Ainsi, lorsque cet ensemble est placé sur le microscope, la distance de travail entre les cellules et l’objectif est inférieure à 200 microns.

Nous sommes maintenant prêts à placer cet échantillon sous un microscope pour l'imagerie. J'ouvre maintenant la chambre d'incubation pour cellules vivantes, je place l'échantillon à l'intérieur et je remets le couvercle de la chambre d'incubation. À ce stade, je parcours le substrat à la recherche d'une cellule appropriée.

Pour l'imagerie. La méthode la plus efficace consiste à utiliser un objectif à contraste de phase de 10 x, ce qui me permettra de visualiser un champ plus large du substrat et de trouver une cellule plus rapidement. Mon critère pour une bonne cellule est qu'il s'agisse d'une cellule unique.

Elle ne doit toucher aucune cellule voisine, et sa taille doit être proche de la taille moyenne par rapport à toutes les autres cellules présentes sur le substrat ; j'ai trouvé une cellule appropriée à observer. La prochaine étape consiste à changer l'objectif pour un objectif 60 x afin d'observer la cellule en fort grossissement. Pour cela, nous défocalisons l'objectif afin d'éviter qu'il heurte la platine pendant la rotation.

Lors de la rotation de la tourelle pour ouvrir la chambre, faites une rotation partielle de l'objectif 60 x jusqu'à ce que l'objectif 60 x soit en position ; l'objectif 60 x est un objectif à immersion huileuse, nous devons donc déposer une goutte d'huile d'immersion sur l'objectif. Nous allons maintenant terminer la rotation de la tourelle pour mettre l'objectif 60 x en place. Nous fermerons ensuite la chambre d'incubation et nous réajusterons la mise au point de l'objectif afin de remettre les cellules au point.

Une fois que j'ai finement ajusté la position et la mise au point de la cellule, je passe à la caméra CCD afin de visualiser la cellule sur l'écran d'ordinateur, puis je commence l'acquisition en laps de temps. Pour cette expérience, nous allons, je vais acquérir à la fois des images en contraste de phase et des images fluorescentes à intervalles d'une minute. L'acquisition en laps de temps a donc commencé, et je la laisse s'exécuter pendant 10 minutes ou 10 images, et à ce moment précis, j'ajoute du sérum. Les 10 minutes sont maintenant écoulées. À ce stade, j'ouvre la chambre et j'ajoute du sérum dans la boîte pour stimuler la contractilité de la cellule.

La minuterie est toujours en marche, donc je dois faire vite. Maintenant, nous allons poursuivre l'acquisition d'images de la cellule pendant 30 minutes afin de suivre les éventuels changements de contractilité. Une fois l'acquisition en laps de temps terminée, les images peuvent être assemblées en un film montrable. Voici deux films des images en contraste de phase et en fluorescence.

À gauche, on voit un film en contraste de phase d'une cellule principalement transparente, délimitée en noir. La cellule s'étend sur les extrémités de 20 piliers, qui sont des structures circulaires disposées en réseau rectangulaire. À droite, un film en fluorescence de la même cellule est présenté, mais seuls les piliers sont visibles.

Si je rejoue ces vidéos, vous verrez que les piliers attachés à la cellule sont initialement faibles, légèrement déviés et s'écartent très peu du réseau rectangulaire. Vers le milieu de la vidéo, j'ai ajouté du sérum au milieu. Le sérum stimule la cellule afin qu'elle augmente sa contractilité.

Lorsque la cellule exerce des forces de traction plus importantes sur les microsouhaits sous-jacents, les microsouhaits situés le long du périmètre de la cellule commencent à s'infléchir vers l'intérieur. Dans la vidéo fluorescente, vous observez désormais des écarts importants des microsouhaits par rapport à leurs positions dans le réseau rectangulaire. Comme je l'expliquerai plus tard, le déplacement de ces positions de microsouhaits dans ces images peut être utilisé pour analyser les forces de traction exercées par cette cellule.

Auparavant, nous avons vu comment nous avions généré les substrats mpad et comment nous les fonctionnalisions afin de cultiver des cellules. Vous avez maintenant remarqué que j'ai placé les substrats mpad finis dans trois boîtes de culture cellulaire différentes. Les cellules ont poussé pendant la nuit, et maintenant je vais traiter chaque boîte de culture cellulaire individuellement avec un agent soluble différent qui module la contractilité d'une manière connue.

Nous pouvons ensuite mesurer de manière quantitative les forces de traction qui résultent, après avoir fixé les cellules pendant 30 minutes. Après l'ajout des facteurs solubles, 30 minutes après l'ajout des inhibiteurs de contractilité, il est maintenant temps de fixer les cellules avec du paraformaldéhyde afin de figer l'état actuel des forces de traction. Pour ce faire, il est important d'utiliser du paraformaldéhyde contenant du calcium et du magnésium, et nous utilisons du paraformaldéhyde à une concentration volumique de 3,7 %. La méthode consistant à immerger les substrats dans le paraformaldéhyde, désolé, est la même que la méthode d'immersion des substrats dans les différents RINs lors de la fonctionnalisation.

C’est-à-dire qu’il est important de ne pas laisser sécher les substrats, car cela pourrait entraîner un effondrement postérieur. Après le transfert des substrats, je les laisse incuber dans le paraformaldéhyde pendant 20 minutes. Une fois les 20 minutes écoulées, nous retirons les substrats du paraformaldéhyde ; désormais que les cellules ont été fixées, nous pouvons traiter ces échantillons pour une immunomarquage standard.

Pour ce faire, nous plaçons les substrats face vers le haut sur du papier parafilm et pipetons suffisamment de PBS pour recouvrir le substrat et le maintenir sous le PBS. Ensuite, nous rinçons le substrat trois fois avec du PBS afin d'éliminer tout paraformaldéhyde qui pourrait rester dans la culture. Après avoir rincé le substrat trois fois avec du PBS, nous pouvons transférer le substrat pour une immunomarquage en aval.

Nous procédons en manipulant le substrat avec une paire de pinces et en inversant lors de la première étape du marquage immunohistochimique, qui consiste en un agent de perméabilisation. Dans ce cas, nous utilisons du Triton X 0,2 % dans du PBS. Toutefois, l’utilisateur peut utiliser l’agent de perméabilisation qui convient le mieux à ses besoins.

Nous répétons cette procédure pour tous nos substrats, et c'est ainsi que nous manipulons les substrats durant le processus de coloration immuno-histochimique. Après la coloration immuno-histochimique, les substrats sont montés sur une lame de verre standard d'un pouce par trois pouces, qui peut ensuite être analysée au microscope à fluorescence épiscopique, qu'il soit inversé ou droit. En analysant les échantillons au microscope confocal, nous pouvons nous focaliser sur la base des piliers afin d'obtenir les positions non déviées, c'est-à-dire nulles.

Nous pouvons ensuite focaliser jusqu’aux extrémités des piliers, prendre une autre image des piliers et, en comparant l’image supérieure à l’image inférieure, mesurer les déflexions des piliers et calculer les forces de traction exercées par les cellules, que les cellules ont générées afin de produire de telles déflexions. En répétant ce processus pour de nombreuses cellules différentes et dans plusieurs conditions distinctes, nous pouvons ensuite comparer les forces de traction générées dans les différentes conditions. Maintenant que nous avons collecté des images de cellules vivantes et fixées, notre prochaine tâche consiste à mesurer la déflexion, à mesurer les forces de traction dans les cellules.

Pour ce faire, nous avons rédigé un programme informatique en matlab. Ce sont les trois images que nous utiliserons dans cette analyse. La première image est une image de phase de la cellule.

Il est utile pour identifier l'emplacement de la cellule. La deuxième image est une image fluorescente des sommets des poteaux. Nous utilisons cette image pour repérer les positions des poteaux à leurs extrémités.

Comme vous pouvez le constater, certains de ces piliers sont déviés et s'écartent de la grille rectangulaire dans laquelle se trouvent la plupart des piliers, comme ce pilier-ci. Et ce pilier-ci. La troisième image que nous utiliserons est l'image de base, qui capture la position des piliers sur un plan focal passant par leur base.

À ce niveau, les poteaux déviés et non déviés doivent se trouver en position de repos, c'est-à-dire en position non déviée. Dans le réseau rectangulaire, on observe que les poteaux qui ont été déviés dans la deuxième image à leur base sont en position FL. Cette image est utilisée pour déterminer la position du poteau, à savoir sa position sous-reflétée.

Ensuite, nous chargeons le programme MATLAB, qui nous invite à charger ces trois images. Donnez un nom au fichier. Vous voyez l'image de phase.

Nous allons dessiner un cadre autour de l'indication de l'emplacement de la cellule, afin que le programme sache quels piliers analyser. Le programme effectue ensuite une analyse d'intensité, un seuillage et une ization de l'image rognée afin de déterminer les coordonnées OID des piliers. À gauche figurent les images ized des piliers provenant de l'image supérieure, tandis qu'à droite figurent les images ized des mêmes piliers provenant de l'image de base.

Après avoir obtenu les coordonnées des micropiliers, le programme peut alors déterminer les vecteurs de déplacement entre l'extrémité et la base de chaque micropilier. Ces vecteurs de déplacement des micropiliers peuvent être convertis en vecteurs de force en les multipliant par la constante de raideur du micropilier. Nous pouvons analyser ces forces cellulaires de différentes manières, par exemple la force moyenne par cellule ou la force moyenne par micropilier.

Un résultat utile est un graphique en flèches à partir duquel nous pouvons visualiser la répartition spatiale des forces. Il s'agit de la cellule que nous venons d'analyser et vous pouvez voir que j'ai superposé des flèches jaunes sur les poteaux, qui correspondent à l'amplitude de la force et indiquent la direction de celle-ci. En répétant ce processus d'analyse d'image pour des séquences d'images, comme celles nécessaires à notre film en accéléré, nous pouvons générer une séquence temporelle.

Voici un film de la cellule que nous avions stimulée avec du sérum. Comme vous pouvez le voir, dès l'ajout du sérum, la cellule augmente sa contractilité et dévie davantage les poteaux. De plus, nous pouvons quantifier les forces pour un plus grand nombre de cellules ayant été soumises à différentes conditions, puis fixées et colorées, comme illustré par ces diagrammes en flèches montrant une cellule traitée avec un composé témoin par rapport à des cellules traitées avec des inhibiteurs de la contractilité.

Comme vous pouvez le constater, les vecteurs de force exercés sur la cellule dans le cas témoin sont plus longs en magnitude que les vecteurs de force dans les deux cas où les inhibiteurs de contractilité ont été utilisés. Nous avons abordé un grand nombre de points afin de décrire le substrat, depuis la microfabrication jusqu’à la préparation des échantillons, en passant par l’expérimentation et l’analyse, afin de démontrer la grande polyvalence de ces substrats.

Nous avons décrit deux tests différents : l'imagerie de cellules vivantes et le test sur échantillons fixés, et nous avons analysé des cellules obtenues à partir de ces deux tests, présentant des graphiques en flèches et des vidéos en flèches. Grâce à cet outil puissant, il est possible d'effectuer une grande variété d'analyses spatiales et temporelles de la contractilité cellulaire. Comme vous l'avez vu, cette méthode s'appuie sur de nombreuses disciplines différentes, notamment la microfabrication, la biologie cellulaire fondamentale, la science des surfaces, l'analyse et le traitement d'images, entre autres.

Et c'est précisément parce que sa méthode repose sur plusieurs techniques d'ingénierie différentes que des paramètres tels que la géométrie des micropiliers, les facteurs solubles induits et les méthodes d'analyse des déflexions des micropiliers peuvent être personnalisés selon les besoins de l'utilisateur. Nous espérons que la démonstration visuelle de cette méthode, que nous avons décrite au cours des 20 à 30 dernières minutes, pourra servir de point de départ à d'autres analyses, plus approfondies, sur la régulation, les conséquences fonctionnelles et la génération des forces d'attraction cellulaires.