L'utilisation d'un piège optique pour l'étude des interactions hôtes pathogènes pour l'imagerie cellulaire dynamique en direct

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser le piégeage optique combiné à la microscopie confocale à disque tournant pour observer en temps réel les interactions entre l'hôte et l'agent pathogène. Cela est réalisé en ajoutant d'abord les agents pathogènes d'intérêt à une chambre en verre couvre-objet. Ensuite, une particule est sélectionnée et capturée à l'aide du piège optique.

Enfin, la particule est dirigée vers la cellule d'intérêt. Comme on le voit ici. Le piégeage optique peut être une méthode efficace pour contrôler deux particules afin d'observer les interactions intracellulaires dynamiques.

Cette méthode peut répondre à des questions importantes concernant les interactions hôte-pathogène dans les domaines des maladies infectieuses et de l'immunologie, notamment quel est l'effet sur la phagocytose lorsque l'on dispose d'un contrôle complet des relations spatiales entre les cellules hôtes et les pathogènes, ainsi que si l'ordre dans lequel les pathogènes sont internalisés par une cellule phagocytaire influence la maturation du phagosome. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car les conditions de piégeage doivent être optimisées selon les types de cellules et de billes. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour le processus de mise en place et d'intégration d'un disque tournant.

La combinaison d'un microscope confocal avec un piège optique est difficile à conceptualiser en raison de l'alignement précis nécessaire entre tous les composants optiques. Récoltez l'agent pathogène d'intérêt. Par exemple, ici, 300 microlitres de Candida albicans cultivés toute une nuit en bouillon sont prélevés à partir du milieu de culture et les agents pathogènes sont transférés dans un tube de réaction de 1,5 millilitre.

Ensuite, laver les agents pathogènes trois fois à environ 1300 Gs pendant cinq minutes à température ambiante, en aspirant le surnageant et en laissant le culot intact à chaque fois dans du PBS repris et soniqué. Après le troisième lavage, resuspendre le culot dans 500 microlitres de PBS. Puis, dissoudre un milligramme de la teinture d'entraînement dans 100 microlitres de diméthylformeamide pour une concentration finale de 10 milligrammes par millilitre.

Ensuite, ajoutez trois microlitres du mélange de colorant dans le tube de réaction contenant les agents pathogènes lavés. Entourez les tubes de papier d'aluminium car les colorants sont sensibles à la lumière, puis agitez l'échantillon à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, centrifugez et lavez l'échantillon dans du PBS 3 fois comme précédemment. Resuspendez le culot dans 300 microlitres de PBS après le dernier lavage.

Réchauffez le milieu et le PVS à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Lavez deux fois une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres recouverte de macrophages RAW 264.7 avec du PBS, en aspirant le PBS entre chaque lavage. Ensuite, recouvrez la surface de la plaque avec cinq millilitres de trypsine et incubez la plaque pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, tapez doucement sur le côté de la plaque pour détacher les cellules de la surface. Veillez à ne pas faire gicler la trypsine hors de la plaque. Ajoutez maintenant cinq millilitres de milieu dans la plaque et transférez le mélange dans un tube à réaction.

Après la centrifugation, aspirez le milieu en prenant soin de ne pas perturber le culot, puis resuspendez le culot dans 10 millilitres de milieu. Ajoutez 400 microlitres de milieu dans chaque chambre d'une lame à chambres, puis ajoutez cinq microlitres de la suspension cellulaire dans chaque chambre. Incubez les cellules toute la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 %CO2.

Retirer la lamelle-chambre de l’incubateur et pipeter de cinq à dix microlitres des agents pathogènes marqués aux fluorochromes préparés précédemment dans chaque chambre contenant des macrophages. Mélanger soigneusement les macrophages et les agents pathogènes en aspirant et en rejetant plusieurs fois par pipetage, en prenant soin de ne pas toucher le fond de la chambre afin de ne pas perturber les macrophages adhérents. Allumer tous les composants du microscope confocal à disque rotatif.

Préparez le microscope en ajoutant de l'huile sur l'objectif à immersion. Insérez la lamelle-chambre sur la platine spécialisée, puis retirez le couvercle de la lamelle-chambre et alignez le microscope pour l'imagerie en contraste interférentiel (DIC). Activez l'obturateur du piège optique et du laser infrarouge (IR).

Ouvrez ensuite l'obturateur du laser vers le piège optique. Vérifiez que l'obturateur devant le laser infrarouge est fermé à l’aide de la carte infrarouge. Mettez maintenant au point sur les macrophages présents sur la lame adhérente.

Ensuite, repérez les agents pathogènes en suspension libre dans la solution adjacente aux macrophages. La partie la plus difficile de cette procédure consiste à trouver l'objet approprié à suivre dans la chambre d'échantillon en raison des forces d'adhérence entre l'objet et le couvre-objet dans la chambre d'échantillon. Pour déplacer cet objet, vous devez déplacer la platine tandis que l'objet est maintenu par le laser de piégeage, et il est également important de noter que vous devez déplacer la platine suffisamment lentement afin que la force de traînée exercée par la platine ne dépasse pas la force maximale de piégeage du piège.

Déplacez la platine de manière à ce que l'agent pathogène se trouve à proximité du piège. Ensuite, ouvrez l'obturateur et activez le piège. Déplacez l'échantillon afin de mettre les macrophages en contact avec l'image stationnaire de l'agent pathogène piégé.

Les agents pathogènes ont été observés au microscope confocal à disque tournant en contraste interférentiel différentiel (DIC), en fluorescence ou selon une combinaison des deux, permettant de distinguer des populations séparées de Candida albicans, dont la taille est généralement d'environ cinq micromètres, colorées en vert, bleu et rouge. Pour illustrer l'imagerie, un seul C. albicans a été piégé et déplacé selon un motif carré à travers un agrégat d'autres levures, comme indiqué par les flèches grises, démontrant ainsi la capacité à capturer et à manipuler la position précise d'un agent pathogène unique sélectionné par l'opérateur, même dans un environnement dense. Afin d'illustrer davantage la souplesse de ce système à piéger les différentes morphologies de forme présentées par les organismes pathogènes, la pince optique a été utilisée pour maintenir et positionner une particule de C. albicans présentant une pseudohyphes.

C. albicans est marquée avec un colorant rouge et déplacée le long d'une trajectoire indiquée par la flèche blanche, puis placée à côté des cellules brutes GFPL C3 fluorescentes. En vert. La partie levure de C. albicans a été piégée tandis que les pseudohyphes s'étiraient.

Aspergillus fum goddess a également été positionné à côté d'une cellule de macrophage de souris brute afin d'analyser le délai absolu de phagocytose avec cette lignée cellulaire particulière et ce pathogène. Sur cette figure, les images en champ clair montrent comment l'Aspergillus piégé, indiqué par la flèche blanche, a été déplacé et positionné le long du trajet indiqué par la flèche rouge. Le pathogène piégé est légèrement flou car le piège pousse l'organisme légèrement au-dessus du plan focal.

Aspergillus a été déplacé jusqu'à ce qu'il soit positionné adjoint à la cellule brute souhaitée. Une fois que le pathogène a établi le contact avec la cellule, le piège a été désactivé. Le processus de phagocytose a été activé et une imagerie en time-lapse a été utilisée pour observer les événements cellulaires ultérieurs.

Au bout de 30 secondes, la membrane de la cellule brute a commencé à se modifier et à former une cupule autour de la particule. À 60 secondes, la cupule était complètement formée. Entre 90 et 150 secondes, l'Afu Gotti devenait progressivement englobé, et à 180 secondes la particule était entièrement internalisée.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment créer un dispositif de piégeage optique à disque tournant, et comment un tel instrument permet de contrôler de manière non invasive les agents pathogènes pour l'imagerie de cellules vivantes après sa mise au point. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des interactions hôte-pathogène pour étudier le rôle des relations spatiales entre les cellules hôtes et les agents pathogènes, ainsi que leur rôle dans la réponse immunitaire qui s'ensuit.