L'utilisation du modèle EpiAirway pour Caractériser long terme Interactions hôte-pathogène

Le but général de l'expérience suivante est de réaliser une co-culture à long terme de l'Haemophilus influenza de type non typable, ou NTHI, avec des tissus épithéliaux respiratoires humains primaires en utilisant le modèle epi airway. Cela est accompli en inoculant la surface apicale avec le NTHI afin de permettre aux bactéries d'adhérer aux tissus et d'y pénétrer, lors d'une deuxième étape. Les inserts sont rincés toutes les 24 heures avec du DPBS préchauffé afin de simuler l'écoulement normal du mucus et d'éliminer les déchets de mucine ainsi que les débris cellulaires.

Ensuite, les tissus sont prélevés au moment souhaité et la survie des cellules totales associées ou des NTHI internalisés est déterminée. Enfin, grâce à cette méthode, les caractéristiques spécifiques aux souches de la survie des NTHI dans les tissus au fil du temps, basées sur le nombre de bactéries viables, peuvent être évaluées. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les infections à long terme causées par l’*Haemophilus influenzae* non typable.

Il peut également être utilisé pour l'étude d'autres pathogènes humains tels que Moraxella Alis. Cette procédure sera démontrée par le Dr. Doin Ran, chercheur postdoctoral dans mon laboratoire. Retirez la plaque de transport de son emballage et préparez-vous à commencer l'expérience. Vaporisez la plaque de transport avec de l'éthanol à 70 % et placez la plaque dans la hotte de sécurité biologique.

Prélevez un millilitre de milieu de maintien épi-airways à quatre degrés Celsius et répartissez-le dans chaque puits d'une plaque à six puits. Ensuite, après avoir retiré le ruban, ouvrez la plaque et enlevez le tampon qui recouvre les inserts épi-airways. À l’aide d’un mouvement de rotation, utilisez une pince pour extraire un insert des aros.

Placer l'insert dans l'un des puits de la plaque à six puits, si nécessaire. Utiliser un coton-tige stérile pour retirer soigneusement les aros de l'insert, en évitant de toucher la membrane. Vérifier qu'aucune bulle d'air n'est piégée sous les inserts.

Ensuite, placer la plaque à six puits dans une étuve. Laver les inserts quotidiennement selon le protocole suivant : préchauffer le DPBS contenant du calcium et du magnésium, puis remplir une pointe avec le DPBS. À l’aide de pinces stériles, prendre délicatement un insert et pipeter 200 microlitres du DPBS préchauffé sur le tissu.

Ensuite, agitez doucement l'insert pour répartir uniformément le DPBS sans toucher le tissu. Puis, inclinez l'insert selon un angle et placez la pointe d'une pipette P 1000 contre l'anneau en plastique qui maintient la membrane au fond de l'insert. Aspirez ensuite soigneusement la solution tampon et transférez-la dans un tube cryogénique pour une analyse ultérieure.

Enfin, aspirez le milieu de maintenance basal et remplacez-le par un millilitre de milieu frais. Préchauffez davantage de DPBS contenant du calcium et du magnésium. Ajoutez trois millilitres de DPBS préchauffé dans un tube de 15 millilitres, puis resuspendez les colonies isolées d'influenza non typable ou de NTHI cultivées toute une nuit sur gélose au chocolat dans le tube.

Agitez maintenant vigoureusement le tube pendant au moins 10 secondes, puis mesurez la densité optique. Continuez à ajouter des colonies isolées de NTHI jusqu'à ce que la concentration bactérienne atteigne une DO à 600 nanomètres d'environ 0,7. Ensuite, lavez chaque insert respiratoire EPI avec du DPBS préchauffé comme précédemment, puis ajoutez 28 microlitres de la suspension bactérienne sur la surface apicale de chaque insert.

Évitez d'ensemencer les milieux de maintenance basaux. Remettez ensuite la boîte au thermostat pour quantifier d'abord le NTHI en préchauffant, puis en séchant en surface des boîtes de gélose au chocolat. Ensuite, diluez en série l'inoculum de NTHI à l'aide de PBS stérile contenant 0,1 % de gélatine ou de PBSG.

Déposez des aliquotes de 10 microlitres de l'inoculum sur les boîtes, puis incubez les boîtes toute la nuit à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, déterminez les UFC par millilitre en comptant la dilution présentant de 15 à 30 colonies distinctes dans chaque goutte, puis en effectuant un calcul rétroactif pour obtenir votre inoculum viable réel de NTHI afin de récolter l'ensemble des bactéries associées aux cellules. Rincez la surface apicale des épi-voies respiratoires trois fois avec 200 microlitres de DPBS sans calcium ni magnésium.

Ensuite, inclinez l'insert et rincez tout milieu de maintenance résiduel de la membrane basale. Placez l'insert lavé dans une nouvelle plaque de six puits et ajoutez 250 microlitres de solution stérile de saponine à 1 % sur la surface apicale de chaque tissu. Remettez la plaque dans l'incubateur pendant 10 minutes, pendant que la plaque s'incube.

Préparer des tubes pour une dilution sérielle en ajoutant 900 microlitres de PBSG dans chaque tube de dilution. Ensuite, frotter le tissu sur la membrane à l’aide d’une pipette P 1000 en effectuant un mouvement de va-et-vient, suivi d’un mouvement circulaire pour détacher le tissu des bords de l’insert. Puis, à l’aide d’une pipette P 1000 stérile à orifice large, transférer la suspension dans un tube einor stérile de 1,5 millilitre vide.

Ajoutez maintenant 250 microlitres de DPBS sur la surface apicale de l'insert, puis examinez l'insert à l'aide d'un microscope inversé à contraste de phase afin de déterminer si des tissus restent à prélever. Ajoutez la suspension dans le tube einor et recouvrez de 500 microlitres de DPBS de manière vigoureuse. Vortexez la suspension cellulaire pendant une minute.

Ensuite, à l’aide d’une seringue stérile d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 26, aspirer la suspension dans la seringue par l’aiguille. Faire passer lentement la suspension à travers l’aiguille trois fois, en prenant soin de ne pas créer de bulles.

Ensuite, vortexer vigoureusement la suspension pendant une minute supplémentaire. Puis, utiliser une pipette à embout large pour transférer 100 microlitres de la suspension dans le premier tube de dilution. Vortexer le tube vigoureusement pendant cinq secondes, puis effectuer une dilution sérielle de un à dix et déposer une goutte de la dilution sur des géloses au chocolat.

Incuber ensuite les plaques toute la nuit à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone afin d'obtenir des dénombrements bactériens viables pour récolter les bactéries internalisées. Laver chaque insert uniquement trois fois avec 200 microlitres de DPBS. Remplacer le milieu de maintenance basal par un milieu contenant 100 microgrammes par millilitre de sulfate de gentamicine, puis ajouter 300 microlitres du milieu de maintenance contenant la gentamicine sur la surface apicale.

Remettez les inserts dans l’incubateur pendant une heure ; pendant que les inserts s’incubent, préchauffez un peu de PBSDP. Ensuite, retirez le milieu de maintenance contenant la gentamicine de la surface apicale. Puis, lavez abondamment la surface apicale et la membrane basale des inserts avec le PBSDP préchauffé.

Enfin, répétez la procédure de brossage et de récolte qui vient d'être démontrée avant d'effectuer des dilutions sérielles et la mise en place des bactéries internalisées sur boîte dans cette figure. En comparant les images de microscopie électronique à balayage de tissus épithéliaux respiratoires non infectés à gauche avec des tissus épithéliaux respiratoires infectés par le NTHI depuis cinq jours à droite, on observe qu'une co-culture prolongée avec le NTHI ne provoque pas de dommages importants aux tissus apicaux, soulignant ainsi l'utilité du modèle épithélial respiratoire.

Ici, un graphique illustre le nombre de NTHI internalisés au cours du temps lors d'une co-culture en épithélium respiratoire. La souche R 2 8 6 6 a été inoculée à environ une fois 10 à la puissance sept UFC par insert. Ensuite, les bactéries internalisées ont été récoltées et dénombrées à chaque point temporel indiqué.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une co-culture à long terme de NTHI avec les tissus respiratoires hormonaux primaires en utilisant un modèle A PRE.