Profilage voltage-dépendants expression d'ARNm de potassium dans les neurones Canal nigrales utilisant une seule cellule de RT-PCR

L'objectif général de cette procédure est de détecter les ARN messagers dans des neurones individuels. Cela est réalisé en effectuant un enregistrement par patch-clamp sur des neurones individuels, puis en aspirant complètement le cytoplasme de chaque neurone enregistré, contenant l'ARNm et le cytoplasme. L'ADNc est ensuite synthétisé et amplifié par PCR.

En fin de compte, des ARNm spécifiques pour des récepteurs, des canaux ioniques et des enzymes peuvent être détectés à l’aide d’un système classique d’imagerie sur gel. Je m’appelle, je travaille au Centre des sciences de la santé de l’Université du Tennessee. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car la quantité d’ARNm dans un seul neurone est extrêmement faible et peut facilement être perdue.

Commencez ce protocole en utilisant un vibrotome pour découper des tranches coronales de cerveau d'une épaisseur de 300 micromètres contenant la partie mésencéphalique rostro-médiane de la substance noire. Les cerveaux peuvent être isolés de rats Sprague-Dawley âgés de 15 à 40 jours. La procédure de découpe des tranches est réalisée à froid, dans une solution de coupe riche en saccharose, oxygénée avec un mélange à 95 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone, et à un pH de 7,4. Incubez les tranches dans un liquide céphalorachidien artificiel saturé avec un gaz à 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'oxygène.

Conserver la température à 34 degrés Celsius et laisser les tranches pendant 45 minutes. Ensuite, maintenir les tranches de cerveau à température ambiante jusqu'à l'enregistrement. Commencer par transférer une tranche de cerveau dans une chambre d'enregistrement de patch clamp.

Perfuser en continu avec un liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné à 32 degrés Celsius. Remplir les pipettes de patch avec une solution intracellulaire autoclavée préparée à l’aide d’eau exempte d’ADN et d’ARN. Abaisser une pipette chargée dans le bain.

Vérifiez que la résistance se situe entre deux et trois mégaohms. Localisez d'abord la substance noire par sa position anatomique distincte. Ensuite, à l'aide d'optiques Namar et d'un objectif 60 x, sélectionnez les grandes cellules de la SNC et de la SNR pour l'enregistrement.

Il s'agit sans hésitation possible de neurones dopaminergiques ou GABAergiques. Utilisez une configuration conventionnelle de type tout-cellule avec scellement étanche de l'ordre du gigaohm pour effectuer des enregistrements en mode potentiométrique et en mode ampèremétrique. Ces enregistrements doivent généralement être réalisés en moins de cinq minutes afin de minimiser la dégradation de l'ARNm.

En environ une minute, il est possible d'obtenir des empreintes électrophysiologiques pour les neurones d'intérêt en enregistrant uniquement leurs propriétés membranaires et de décharge. Après avoir obtenu les données d'un neurone d'intérêt, appliquez une aspiration douce par la bouche pour aspirer le cytoplasme. Le scellement étanche ne doit pas être rompu, sinon.

Les débris extracellulaires, notamment l'ARNm, peuvent être aspirés dans la pipette de patch et contaminer le contenu cellulaire. Expulsez le contenu cellulaire dans un tube PCR de 0,2 millilitre en brisant l'extrémité de la pipette et en appliquant une légère pression positive. Une fois terminé, placez immédiatement le tube dans un congélateur à moins 20 pour éliminer tout risque de contamination par des débris extracellulaires pouvant contenir des ARNm.

Préparez un témoin négatif en recueillant le contenu d'une micropipette appliquée sur le tissu sans aspiration. Dès que le contenu cellulaire provenant de 10 à 20 neurones a été recueilli, commencez immédiatement la réaction de transcription inverse. Pour minimiser la dégradation des ARNm, commencez par digérer tout ADN génomique contaminant à l'aide de DNase, pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius.

Cette étape est cruciale pour réduire les faux positifs potentiels et ne doit pas être contournée. Ensuite, inactiver l'ADN en ajoutant 1,2 microlitre de EDTA à 25 millimolaire et incuber les échantillons à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Utilisez maintenant un kit disponible dans le commerce pour synthétiser l'ADN complémentaire afin de vérifier que l'ADN génomique a été complètement éliminé.

Effectuez une réaction témoin pour chaque échantillon sans transcriptase inverse. Tous les autres composants de la réaction restant identiques. Conservez les produits à moins 20 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires pour la conception de la PCR.

Des amorces conçues selon les séquences présentes dans GenBank, chaque fois que possible, doivent présenter une modification T intro chevauchant les réparations d'amorces afin de faciliter la détection d'une contamination par de l'ADN génomique. Pour vérifier l'efficacité des paires d'amorces, testez-les sur de l'ADNc de cerveau entier au premier stade. Amplifiez par PCR cinq microlitres des 30 microlitres d'ADNc pendant 35 cycles en utilisant un protocole standard de cyclage thermique.

Pour la deuxième étape, amplifiez par PCR un microlitre du produit de la première étape de PCR avec l'enzyme Prime Repair, en utilisant un profil de cyclage légèrement modifié. Séparez ensuite les produits sur un gel d'agarose à 2,5 % et visualisez-les à l'aide de bromure d'ethidium ou de Gel Green. Sous lumière UV, excisez les bandes d'ADN positives et séquençez-les à l'aide d'un kit disponible commercialement afin d'isoler l'ADN.

Les caractéristiques électrophysiologiques des neurones de la substance noire, pars compacta et pars reticulata, ont été comparées. Les neurones GABAergiques du SNR présentaient une fréquence plus élevée de décharges spontanées d'environ 10 hertz. Les potentiels d'action avaient une durée de base d'environ un milliseconde lors de l'injection d'un courant hyperpolarisant.

Les neurones GABAergiques du SNR présentaient une réponse SAG subtile, indiquant un courant faiblement activé. En revanche, les neurones dopaminergiques nigraux exhibaient des sursauts spontanés de faible fréquence, avec une durée de base d'environ trois millisecondes. Les neurones dopaminergiques montraient également une SAG prononcée en réponse à l'hyperpolarisation, indiquant une forte expression du courant IH dans les neurones GABAergiques du SNR, mais pas dans les neurones dopaminergiques.

La R-T-P-C-R à cellule unique a détecté l'ARNm de la glutamate décarboxylase 1, une enzyme clé de la synthèse du GABA. En revanche, une SNC et des neurones dopaminergiques du SNR ont été identifiées, mais pas les neurones GABAergiques. La R-T-P-C-R à cellule unique a détecté l'ARNm de la tyrosine hydroxylase, une enzyme clé de la synthèse de la dopamine.

Ensuite, la R-T-P-C-R à cellule unique a été utilisée pour analyser l'expression des sous-unités du canal KV trois activé par le voltage, qui modulent les propriétés des canaux potassium dépendants du voltage. Dans l'exemple de neurone SNR gaba, les ARNm de neurones KV 3.1, 3.2, 3.3 et 3.4 ont été détectés uniquement dans un neurone S-N-R-D-A représentatif. KV 3.2, 3.3 et 3.4 ont été détectés dans les données regroupées.

KV 3.1 a été détecté plus fréquemment dans les neurones GABAergiques de la SNR que dans les neurones dopaminergiques nigraux, indiquant un niveau d'expression plus élevé de KV 3.1 dans les neurones GABA de la SNR à décharge rapide. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de porter des gants et de maintenir les outils exempts de contamination après leur mise au point. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine des neurosciences pour explorer l'expression et la fonction des récepteurs ainsi que des canaux ioniques dans le système nerveux.