Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser diverses approches virologiques et biochimiques pour analyser le rôle d'une voie de signalisation de l'hôte dans la réplication lytique d'un virus herpétique modèle. Ici, à titre d'exemple, nous examinons le rôle de la protéine mitochondriale de signalisation antivirale Mavs durant une infection par le virus herpétique gamma HV 68. Premièrement, afin d'étudier le rôle de Mavs durant une infection aiguë, des souris de type sauvage et des souris invalidées pour Mavs sont infectées par le gamma HV 68 suite à une infection virale aiguë.

Le poumon de souris est prélevé et les charges virales sont déterminées par un dosage de plaques au cours duquel les échantillons sont dilués en série et ensemencés. Le nombre de plaques est ensuite décompté sur des monocouches. Une augmentation des charges virales chez les souris knock-out suggère que le gène d'intérêt joue un rôle antiviral.

En revanche, la réduction des charges virales chez les souris invalidées indique que le gène est nécessaire à l'infection virale. Afin de valider ces résultats, la cinétique de multiplication virale en plusieurs étapes est analysée in vitro dans des fibroblastes embryonnaires de souris. Des fibroblastes embryonnaires de souris de type sauvage et des fibroblastes embryonnaires de souris invalidées pour mavs sont infectés avec le virus gamma HV 68 et incubés pendant différentes durées. Les cellules sont ensuite recueillies et des dosages par plaque sont réalisés afin de comparer la cinétique de multiplication en plusieurs étapes entre les cellules de type sauvage et les cellules déficientes en mavs.

Pour valider davantage ces résultats, des cellules de fibroblastes embryonnaires de souris de type sauvage et des cellules invalidées pour mavs sont infectées par le virus gamma HV 68. Ensuite, l'ADN et l'ARN sont extraits séparément à partir des cellules infectées, puis les transcrits génomiques viraux sont analysés par PCR en temps réel. Nous avons eu cette idée pour la première fois en étudiant le rôle d'une voie immunitaire de l'hôte durant une infection lytique virale.

Ce protocole pourrait être appliqué pour étudier les mécanismes des voies de signalisation de l'hôte durant l'infection par d'autres agents pathogènes. Commencez cette procédure en laissant des souris syngéniques de sexe identique âgées de six à huit semaines s'acclimater pendant une période de quatre jours après leur livraison. L'expérience suivante sera réalisée dans une installation de biosécurité.

En préparation, portez des équipements de protection individuelle comprenant une blouse de laboratoire, des gants, un masque et des surchaussures, en travaillant dans une cabine de sécurité biologique de niveau deux. Préparez la suspension virale avec 40 à 10 000 PFU de gamma HV 68 et 30 microlitres de PBS stérile pour chaque souris devant être infectée.

Gardez la suspension virale sur de la glace après une injection intrapéritonéale de kétamine-xylazine. Assurez-vous que les souris sont sédées en effectuant une pincée du orteil. Ensuite, à l’aide d’une pipette, appliquez goutte à goutte 30 microlitres de la suspension virale dans la narine gauche ou droite.

Placer la souris sur le côté pendant cinq à dix minutes afin de faciliter l'acheminement du virus vers les voies respiratoires et dans le poumon. Ensuite, remettre les souris dans leur cage et les surveiller jusqu'à ce qu'elles se soient complètement remises de la sédation. Puis prélever le tissu pulmonaire des souris injectées afin de préparer un lysat cellulaire pour évaluer le titre viral à différents jours post-infection.

Placer les poumons prélevés sur des souris sacrifiées dans des tubes stériles de 1,5 millilitre à visser contenant 500 microlitres de billes de zircone-silice de 1,0 millimètre, sur de la glace. Si l'on n'enchaîne pas directement avec l'étape suivante le même jour, conserver les échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Sinon, ajoutez un millilitre de DMEM sans sérum, froid. Placez le tube dans un homogénéisateur à billes et appuyez sur démarrer pour homogénéiser les poumons pendant 30 secondes. Cela permet d'éviter la surchauffe de l'échantillon, qui pourrait inactiver le virus.

Placer le tube sur de la glace pendant au moins une minute après 30 secondes d'homogénéisation. Répéter ensuite ce processus. Puis, centrifuger le tissu homogénéisé à 16 000 RCF à quatre degrés Celsius pendant une minute.

Après la centrifugation, les débris cellulaires se trouveront au fond du tube et les lipides à la surface. Prélevez immédiatement le surnageant comme indiqué ici pour réaliser un dosage des plaques en utilisant une monocouche de NIH trois T trois ou de BHK 21. Ensuite, un dosage des plaques est effectué afin de déterminer la titration virale présente dans l'échantillon ; commencez le dosage des plaques en réalisant une dilution sériée du surnageant viral.

Tout d'abord, à l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 270 microlitres de milieu dans une plaque de 96 puits. Laissez la première rangée vide. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de surnageant dans la première rangée de la plaque de 96 puits, chaque échantillon en triple exemplaire.

Ensuite, transférez 30 microlitres de l'échantillon de la première rangée vers la rangée suivante et mélangez. Puis transférez 30 microlitres du mélange à la rangée suivante et mélangez. Répétez cette étape plusieurs fois afin d'effectuer des dilutions sérielles d'un facteur dix.

Ensuite, ajoutez le surnageant viral dilué sur la monocouche cellulaire. Dans une plaque de 24 puits, placez la plaque dans un incubateur et agitez-la toutes les 30 minutes pendant une incubation de deux heures. Après l'incubation, pour éliminer les débris cellulaires, aspirez le surnageant de la plaque.

Ensuite, lavez les cellules une fois avec du milieu frais. Après le lavage, ajoutez du milieu contenant de la méthylcellulose aux cellules. Incubez les cellules pendant quatre à six jours.

Après un délai de quatre à six jours, utilisez un microscope pour lire le nombre de plaques pour chaque échantillon. Enregistrez le nombre de plaques pour chaque dilution.

Ensuite, calculez la moyenne et l'écart type. Les puits contenant trop ou pas assez de plaques ne peuvent pas être utilisés pour calculer précisément le titre. Ainsi, pour chaque échantillon, utilisez une dilution dans laquelle il y a de sept à 70 plaques.

Cet échantillon dilué 1000 fois présente en moyenne 23 plaques par puits. Pour calculer le titre viral dans la solution non diluée, multipliez le facteur de dilution par le nombre de plaques et par le nombre de microlitres dans un millilitre. Divisez ensuite ce résultat par le volume de surnageant dilué ajouté par puits.

Ainsi, dans cet exemple, 1000 multiplié par 23 plaques multiplié par 1000 microlitres par millilitre, divisé par 100 microlitres, donne 2,3 fois 10 à la puissance 5 unités formant des plaques par millilitre. Ensuite, une solution virale de concentration connue est utilisée pour déterminer la cinétique de croissance du gamma HV 68 dans des fibroblastes embryonnaires de souris. Commencez par répartir des cellules de type sauvage et des cellules déficientes pour un gène hôte dans une plaque de 24 puits, à raison de 10 000 cellules par puits. Le jour suivant, remplacez le milieu dans chaque puits par 0,5 millilitre d'une suspension de gamma HV 68 à faible taux de multiplicité d'infection (MOI).

Placer la plaque dans l'incubateur à 37 degrés Celsius et laisser l'incubation se poursuivre pendant deux heures. Agiter doucement la plaque toutes les 30 minutes après l'incubation. Utiliser une pipette pour éliminer la suspension virale et ajouter 0,5 millilitre de DMEM complet frais contenant 8 % de sérum de veau fœtal sur les cellules infectées par le virus.

Remettre les cellules dans l’incubateur à différents jours post-infection. Récolter le milieu et les cellules en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Transférer immédiatement dans des tubes de centrifugation stériles de 1,5 millilitre et congeler les tubes à moins 80 degrés Celsius pour libérer le gamma HV 68 des Mets.

Effectuez trois cycles de congélation et de décongélation. Décongelez les cellules en les plaçant à 37 degrés Celsius. Ensuite, vortexez-les et remettez-les au congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Déterminez le titre viral par un dosage de plaques en utilisant une monocouche de NIH trois T trois ou de BHK 21, comme indiqué précédemment, afin d'examiner si la réplication de l'ADN ou de l'ARN est affectée par un déficit des gènes de l'hôte ou des gènes viraux. Commencez par des MES infectés à différents jours post-infection, jetez le surnageant, rincez les cellules avec du PBS froid et détachez les cellules à l'aide de trypsine sur de la glace. Ensuite, faites précipiter les cellules par centrifugation à 1000 RCF à température ambiante pendant une minute ; après la centrifugation, jetez le surnageant et conservez les cellules à −80 degrés Celsius.

Extraire l'ADN et l'ARN totaux, d'origine hôte et virale. Ensuite, centrifuger les colonnes de centrifugation. Réaliser une PCR en temps réel en utilisant l'ADN total et des amorces spécifiques des transcrits lytiques viraux.

Déterminez la quantité relative du génome intracellulaire de gamma HV 68 par rapport à un gène ménager de l'hôte tel que l'actine bêta. Préparez de l'ADNc à partir d'ARN total et d'un amorce oligo DT. Réalisez une PCR en temps réel en utilisant l'ADNc et les amorces décrites ci-dessus afin de déterminer la quantité relative des transcrits viraux.

Par rapport à celui du gène ménager de l'hôte, Mavs est l'abréviation de signalisation antivirale mitochondriale, comme indiqué ici. La molécule adaptatrice Mavs transmet le signal depuis les récepteurs intracytoplasmiques de type RIG-I afin d'activer NF-κB et les facteurs régulateurs d'interféron (IRF), qui à leur tour augmentent l'expression génique des cytokines pro-inflammatoires et des interférons. Les charges virales dans les poumons de souris sauvages infectées par le gamma HV et de souris appariées déficientes en Mavs sont présentées ici.

Le déficit en Mavs a réduit de manière significative la charge virale dans les poumons à 10 jours post-infection, indiquant que Mavs est nécessaire à une infection virale efficace in vivo. Cette figure présente une courbe de croissance virale multiphasique sur des fibroblastes embryonnaires de souris de type sauvage et sur des cellules déficientes en Mavs. Une croissance virale nettement retardée a été observée sur les fibroblastes embryonnaires de souris, indiquant que Mavs est requis pour une réplication virale efficace in vitro. Les niveaux d'ARNm des gènes lytiques viraux dans des fibroblastes embryonnaires de souris infectés par le gamma HV 68 ont été analysés par PCR en temps réel. Le déficit en Mavs a réduit de manière significative les niveaux d'ARNm de trois gènes lytiques essentiels.

Tous ces résultats soutiennent collectivement la conclusion que Mavs est nécessaire à l'activation de la transcription du gamma HV 68 et à la réplication lytique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser l'interaction hôte-pathogène à plusieurs niveaux, tant dans le VO que dans le Vevo. N'oubliez pas que le travail avec des agents pathogènes peut être extrêmement délicat.

Des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle doivent être prises pendant les interventions.