L'augmentation des rendements d'ADNc de cellule unique quantités d'ARNm dans les réactions de laboratoire standard de la transcriptase inverse en utilisant Microstreaming acoustique
11 juillet 2011
Nous décrivons une nouvelle méthode pour augmenter le rendement d'ADNc de cellule unique quantités d'ARNm dans les réactions de laboratoire standard de transcription inverse contraire. La nouveauté réside dans l'utilisation d'un micromélangeur, qui utilise le phénomène de la microstreaming acoustique, de mélanger les liquides à l'échelle du microlitre plus efficacement que secouer, vortex ou trituration.
Cette procédure augmente les rendements d'ADNc à partir de quantités d'ARNm provenant d'une seule cellule. Commencez par équilibrer le micro-mélangeur à l'intérieur d'un incubateur réglé à la température souhaitée pour la réaction de transcription inverse. Préparez ensuite des réactions standards de RT en laboratoire, comprenant des quantités d'ARN provenant d'une seule cellule, en volumes microlitriques.
Placer fermement le tube à réaction dans les orifices de mélange, sélectionner les paramètres de mélange appropriés, puis mettre en marche le micromélangeur. En fin de compte, cette procédure peut être utilisée pour obtenir des rendements accrus d'ADNc par PCR quantitative en vue de la préparation de la réaction de RT. Équilibrer le micromélangeur dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure.
Dans des tubes PCR stériles standards sans nucléase de 200 microlitres à paroi fine. Préparez les réactions de transcriptase inverse conformément aux instructions du fournisseur, sauf qu'il faut utiliser des quantités d'ARN total équivalentes à une seule cellule. Sélectionnez maintenant la fréquence et l'amplitude appropriées du mélange micrométrique.
Placez ensuite le tube fermement dans le micromélangeur. Ensuite, allumez le micromélangeur. Laissez la réaction se dérouler pendant 60 minutes ; une fois terminée, éteignez le micromélangeur et transférez les réactions sur de la glace pour une utilisation immédiate dans des applications en aval ultérieures. Par rapport à d'autres méthodes, l'avantage principal du micromélange dans le contexte des réactions de transcription inverse est le rendement en ADN.
Dans cette analyse par réaction de polymérase en chaîne quantitative, les tracés de PCRq obtenus à l’aide d’amorces conçues pour détecter l’ADNc représentant l’ARNm de neuro une illustrent les effets du mélange microm pendant les cinq premières minutes ou les 60 minutes complètes, comparés à la durée de la réaction de RT immédiatement avant l’incubation de RT. Le mélange microm pendant les cinq premières minutes n’a pas entraîné d’amélioration significative par rapport à l’agitation. Toutefois, le mélange microm pendant les 60 minutes complètes a produit une amélioration significative du rendement, équivalente à 15 cycles de PCRq.
En outre, l'analyse de la courbe de fusion de la QPCR démontre que le mélange micro pour les 60 minutes complètes de la réaction précédente R deux produit un signal cohérent dans les échantillons en double, comme indiqué par les tracés rouges. Ceci contraste avec les tracés variables observés avec un mélange micro pendant les cinq premières minutes, comme indiqué en bleu, ou avec l'agitation uniquement, comme indiqué par les tracés gris-noir qui correspondent à des témoins sans matrice.
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Aperçu
Cet article présente une méthode novatrice pour augmenter le rendement d'ADN complémentaire à partir d'ARNm de cellule unique en utilisant un micromélangeur. La technique exploite le microcourant acoustique pour améliorer le mélange des fluides dans des réactions standard de transcription inverse.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biotechnologie
- Génomique
Contexte
- La synthèse d'ADN complémentaire est essentielle pour l'analyse de l'expression génique.
- L'analyse au niveau cellulaire unique pose des défis en termes de rendement en ARN.
- Les méthodes traditionnelles de mélange peuvent s'avérer insuffisantes pour les petits volumes.
- Le micro-mélange acoustique offre une solution potentielle pour améliorer le mélange.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant d'augmenter le rendement en ADNc à partir d'ARNm de cellule unique.
- Utiliser un micromélangeur pour améliorer le mélange des fluides.
- Évaluer l'efficacité de cette méthode dans des réactions de RT standard.
Méthodes utilisées
- Équilibrer le micromélangeur dans un incubateur à 37 °C.
- Préparer des réactions standards de transcription inverse à partir d'ARN monocellulaire.
- Placer les tubes à réaction dans le micromélangeur.
- Régler les paramètres de mélange et activer le micromélangeur.
Résultats principaux
- Des rendements accrus de ADN complémentaire ont été observés par rapport aux méthodes traditionnelles.
- Le micromélangeur a efficacement amélioré le mélange à l'échelle microlitrique.
- Les résultats de PCR quantitative ont confirmé les rendements améliorés.
- La méthode est applicable à diverses analyses d'ARN unicellulaires.
Conclusions
- Le micromélangeur offre un avantage significatif pour la synthèse d'ADN complémentaire à partir d'ARNm de cellules uniques.
- Cette approche peut faciliter des études plus précises de l'expression génique.
- Des applications futures pourraient inclure des analyses transcriptomiques plus larges à l'échelle de la cellule unique.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Améliorer le rendement en ADNc à partir de l'ARNm de cellules uniques permet de surmonter un goulot d'étranglement critique dans les flux de travail de validation ciblée et de criblage phénotypique. En permettant d'analyser un plus grand nombre de gènes par cellule avec une précision quantitative, cette méthode renforce la fiabilité prédictive des décisions prises en phase initiale de découverte. L'approche contribue à réduire les risques associés aux hypothèses thérapeutiques grâce à des lectures moléculaires reproductibles et évolutives issues d'échantillons biologiques limités.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en augmentant le nombre de gènes cibles détectables par cellule unique.
- Valeur opérationnelle : Réduit la variabilité technique lors de la conversion d'ARNm en ADNc, améliorant ainsi la cohérence du test entre les réplicats.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles grâce à une détection plus fiable des transcrits peu abondants liés aux mécanismes de la maladie.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des bibliothèques d'ADNc validées pour le criblage en aval, augmentant la sensibilité de détection des hits.
- Valeur opérationnelle : Standardise le traitement de l'ARN d'entrée à l'aide d'équipements de laboratoire accessibles, améliorant le débit.
- Valeur de plateforme : Compatible avec les réactifs standards de RT et les analyses de qPCR, facilitant l'intégration dans les cascades de criblage existantes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la découverte de biomarqueurs à partir de populations cellulaires rares en améliorant les limites de détection pour les cibles transitoires ou faiblement exprimées.
- Valeur opérationnelle : Fournit des résultats quantitatifs et reproductibles qui favorisent l'alignement entre les équipes de découverte et précliniques.
- Atténuation des risques : Réduit les risques de faux négatifs lors de la validation des cibles en augmentant le rendement en ADN complémentaire sans nécessiter d'infrastructure microfluidique spécialisée.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, en soutenant spécifiquement la transition de la génération d'hypothèses sur la cible à l'identification de composés candidats, en améliorant la qualité et la quantité des entrées moléculaires destinées au criblage fonctionnel.
- Biologie de la découverte : Améliore la validation des cibles en permettant un profilage transcriptionnel complet à partir de quantités d'ARNm provenant d'une seule cellule.
- Écrans : Améliore la préparation des tests grâce à un rendement accru en ADN complémentaire, facilitant la détection fiable des variations d'expression induites par des composés.
- Analytique : Génère des résultats quantitatifs compatibles avec la qPCR, permettant des comparaisons statistiques de l'expression génique entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité avec les travaux précliniques en permettant la détection de transcrits pertinents pour la maladie dans des échantillons limités de cellules primaires.
- Réutilisation en entreprise : Constitue une capacité évolutible et peu coûteuse, applicable à plusieurs projets et systèmes modèles sans nécessiter de plateformes microfluidiques dédiées.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant le bruit technique lors de la synthèse d'ADN complémentaire à partir d'ARN en quantité limitée.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'extensibilité des protocoles d'expression génique unicellulaire en utilisant du matériel de laboratoire standard.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions « aller/ne pas aller » en permettant un profilage moléculaire plus complet par échantillon, réduisant ainsi les faux négatifs biologiques.
- Impact sur le portefeuille : Favorise l'avancement ajusté au risque en renforçant la confiance dans les données d'engagement des cibles et de modulation des voies issues des analyses unicellulaires.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une connaissance des principes de la microcirculation acoustique et de l'optimisation des paramètres de fréquence et d'amplitude pour des volumes réactionnels spécifiques.
- Dépend de l'accès à un incubateur thermostaté et à des tubes PCR à parois minces compatibles pour une formation efficace du ménisque.
- Implique la standardisation de la durée de mélange et des réglages de puissance entre les utilisateurs afin de garantir des rendements reproductibles en ADN complémentaire.
- Suppose la validation de l'intégrité des acides nucléiques après le mélange afin de confirmer l'absence de dégradation due à des effets mécaniques ou thermiques.
- Limité aux applications où l'augmentation du rendement en ADN complémentaire améliore directement la sensibilité analytique en aval, comme la PCR quantitative ou la préparation de bibliothèques de séquençage.
